CUL4相关因子7、微RNA-589-5p在结直肠癌组织中表达与临床病理特征及预后的关系

杨洋，王高波，李文清，王佳，杨博伟，马蓉

作者单位：宝鸡市人民医院结直肠肛门外科，陕西 宝鸡721000

据全球数据统计，2020 年结直肠癌的全球发病率位居第3 位，死亡率位居第2 位［1-2］。结直肠癌也是我国的第三大常见恶性肿瘤［3］。寻找有效的分子靶标对改善结直肠癌病人预后有重要作用。相关研究显示，微RNA 与结直肠癌的发生、发展及预后存在密切关系［4-6］。微RNA-589-5p（miR-589-5p）可调控细胞的增殖、凋亡［7］。He 等［8］研究显示，miR-589-5p 低表达促进喉癌细胞的增殖迁移。Qian 等［9］通过分析显示，CUL4 相关因子7（DCAF7）对转移性肾细胞癌具有诊断价值，且对肾细胞癌病人预后具有良好的预测价值。笔者通过检索Target Scan Human 网站发现，miR-589-5p 与DCAF7 存在结合位点。本研究选取结直肠癌病人78例为研究对象，探究miR-589-5p、DCAF7在结直肠癌中临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料纳入2018 年9 月至2019 年9 月于宝鸡市人民医院行结直肠癌根治术的78例病人，年龄范围32～73 岁，年龄（53.29±11.61）岁，男性46 例，女性32 例。手术过程中留取癌旁组织及结直肠癌组织，癌旁组织距离肿瘤组织上缘＞5 cm，组织冲洗后，液氮冷冻。TNM 分期参照第7 版（2010）结直肠癌美国癌症联合委员会（AJCC）分期标准［10］。纳入标准：①术后标本经病理诊断为结直肠癌；②原发性结直肠初诊者；③年龄大于20 岁。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②术前接受过肿瘤放、化疗；③合并心、肝、肾等严重疾病者；④存在自身免疫缺陷疾病。病人或其近亲属知情同意，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 检测结直肠癌组织中miR-589-5p、DCAF7 mRNA 表达水平使用TRIzol 试剂（北京百奥莱博科技有限公司）提取组织总RNA，用NanoDropND-1000 分光光度仪（美国NanoDrop Tech 司）检测RNA的纯度及浓度，依据Primescript RT Reagent Kit（日本TaKaRa公司）说明书反转录得到互补DNA（cDNA）。采用7300 型实时荧光定量PCR 仪（美国ABI 公司）对miR-589-5p、DCAF7 mRNA及内参U6、β肌动蛋白（β-actin）进行扩增反应。按照试剂盒说明书建立反应体系，每个样品设3个复孔。miR-589-5p、U6引物由上海生工合成。反应条件：95 ℃，3 min；95 ℃，30 s；61 ℃，30 s；72 ℃，30 s；40 个循环。反应结束后收集数据，并对所得数据Ct 值进行分析，用2-ΔΔCt法计算miR-589-5p相对表达量。引物设计见表1。

表1 实时荧光定量PCR法引物序列

1.3 免疫组化检测结直肠癌组织中DCAF7蛋白表达采用免疫组化染色法检测DCAF7 蛋白表达。阴性对照采用生理盐水磷酸盐缓冲液（PBS）。结果判定：由2位专业人员盲法审片，每个实验结果选取5个高倍镜视野进行计数。DCAF7阳性表达为出现棕黄色至棕褐色颗粒。按染色强度计分：无着色（0分），浅黄色（1分），棕黄色（2分），棕褐色（3分）。阳性细胞所占百分比评分：≤10%记0 分，11%～50%计1 分，51%～75%计2 分，＞75%计3 分。两次评分乘积为最终得分，≤2分为阴性表达，＞2分为阳性表达。

1.4 随访从结直肠癌病人入院手术后开始随访，随访至2021年9月，最长随访时间3年，以电话或门诊方式随访。记录病人总生存时间，即开始治疗到至因任何原因引起死亡的时间。

1.5 Ualcan 数据库检索在Ualcan 数据库（http：∕∕ualcan.path.uab.edu）中检索。设定gene symbol 分别为miR-589-5p、DCAF7，设定用TCGA 数据库为Colon adenocarcinoma，分析miR-589-5p、DCAF7表达。

1.6 细胞实验

1.6.1细胞培养 将结直肠癌细胞（SW837）及人结肠上皮细胞NCM460接种于含有1%双抗+10%胎牛血清（FBS）的DMEM 培养基中，常规培养。待细胞融合度到70%～80%时，传代2～3次。

1.6.2分组及转染 将SW837 细胞接种到6 孔板（2×105个∕孔）中在培养箱培养24 h 后，细胞分为Control 组、mimic 组、miR mimic 组，miR mimic+pc-NC 组，miR mimic+pc-DCAF7 组，使用Lipofectamine™2000 试剂盒分别将mimic、miR-589-5p mimic、pcDNA3.1、pcDNA3.1 DCAF7 转染至各组SW837 细胞，48 h 后，收取转染细胞，实时荧光定量PCR 法检测miR-589-5p、DCAF7表达。

1.6.3Transwell 实验检测SW837 细胞侵袭能力取“1.6.2”方法中的各组SW837 细胞，Transwell 小室上室中Matrigel 胶晾干后，吸取200 μL 细胞悬液注入Transwell 小室上室内，下室添加500 μL 培养基，培养箱常规培养48 h，擦去未过膜的SW837 细胞，无水乙醇固定（15 min）后进行结晶紫染色（25 min），在镜下随机选择5个视野，计算侵袭细胞数。

1.6.4双萤光素酶报告基因检测miR-589-5p、DCAF7 的靶向关系 使用TargetScanHuman 网站预测miR-589-5p 与DCAF7 的结合位点；扩增与miR-589-5p结合的DCAF7 3’UTR 片段，与pmirGLO 载体连接构建pmirGLO-DCAF7-wt 野生型载体；使用定点突变技术将结合片段突变，构建pmirGLODCAF7-mut 突变型载体。将SW837 细胞分为pmir-GLO-DCAF7-wt+miR-589-5p mimic 组、pmirGLODCAF7-wt+mimic NC 组、pmirGLO-DCAF7-mut+miR-589-5p mimic 组、pmirGLO-DCAF7-mut+mimic NC组，将pmirGLO-DCAF7-wt、pmirG LO-DCAF7-mut、mimic NC、miR-589-5p mimic 分别转染至SW837 细胞中，24 h后检测海肾及萤火虫萤光值，计算相对萤光素酶活性。

1.7 统计学方法采用软件SPSS 25.0 对数据进行分析，计量资料（miR-589-5p 相对表达量等）以表示，多组间比较采用方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料（DCAF7 蛋白表达）用例（%）表示，采用χ2检验。Spearman 法分析分析织miR-589-5p 与DCAF7 的相关性。采用Kaplan-Meier法分析结直肠癌组织miR-589-5p、DCAF7 表达与病人预后的关系，行log-rank 检验；多因素Cox 回归分析影响结直肠癌预后的因素。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ualcan 数据库中结肠腺癌组织和癌旁组织miR-589-5p、DCAF7表达水平比较Ualcan 数据库中，结肠腺癌组织中miR-589-5p 表达水平低于癌旁组织（P＜0.001）；结肠腺癌组织DCAF7 表达水平高于癌旁组织（P＜0.001）。见图1，2。

图1 结肠腺癌癌旁组织与癌组织中miR-589表达水平比较

2.2 miR-589-5p、DCAF7 在结直肠癌组织上的表达水平与癌旁组织DCAF7 阳性表达率12.82%（10∕78）相比，结直肠癌组织中DCAF7 阳性表达率62.82（49∕78）相对表达水平较高（χ2=41.46，P＜0.001）。与癌旁组织相比，结直肠癌组织中DCAF7 mRNA 相对表达水平较高（P＜0.05），miR-589-5p 相对表达水平较低（P＜0.05），见表2。

表2 miR-589-5p在结直肠癌组织和癌旁组织表达水平比较∕

表2 miR-589-5p在结直肠癌组织和癌旁组织表达水平比较∕

注：miR-589-5p为微RNA-589-5p，DCAF7为CUL4相关因子7。

2.3 结直肠癌癌组织miR-589-5p 和DCAF7 表达水平的相关性根据miR-589-5p 平均值（0.44）将结直肠癌组织分为高表达组36 例（其中DCAF7 阳性表达12 例，阴性表达24 例），低表达组共42 例（其中DCAF7 阳性表达37 例，阴性表达5 例），经Spearman 相关分析显示，组织中miR-589-5p 与DCAF7 表达水平呈负相关（r=-0.56，P＜0.05）。

2.4 miR-589-5p、DCAF7 表达与结直肠癌病人临床病理特征的关系观察结果显示miR-589-5p、DCAF7 均与淋巴结转移、肿瘤浸润深度相关（P＜0.05），与病人年龄、性别、TNM分期、肿瘤长径、组织分化程度无关（P＞0.05）。详见表3。

表3 miR-589-5p、DCAF7表达与结直肠癌临床病理特征的关系∕例（%）

2.5 miR-589-5p、DCAF7 表达与结直肠癌病人预后的关系Kaplan-Meier 法显示miR-589-5p 高表达组生存时间为（32.06±1.30）个月，显著长于miR-589-5p 低表达结直肠癌病人（24.25±1.73）个月，log Rank 检验，χ2=10.55，P=0.001。DCAF7 阴性表达生存时间为（31.51±1.55）个月，显著长于DCAF7 阳性（25.52±1.59）个 月，Log Rank 检 验，χ2=6.22，P=0.013。见图3。

图2 结肠腺癌癌旁组织与癌组织中CUL4相关因子7（DCAF7）表达水平比较

图3 miR-589-5p、CUL4相关因子7（DCAF7）表达水平与结直肠癌病人预后的关系：A为miR-589-5p表达水平与结直肠癌病人预后的关系；B为DCAF7表达水平与结直肠癌病人预后的关系

2.6 影响结直肠癌病人预后的因素分析单因素分析表明，肿瘤浸润深度、淋巴结转移、miR-589-5p、DCAF7 均是影响结直肠癌病人不良预后的危险因素，见表4。多因素分析表明，淋巴结转移（无转移∕有转移）HR及 其95%CI为1.80（1.10，2.96）（P=0.020）、miR-589-5p（高表达∕低表达）HR及其95%CI为1.92（1.26，2.93）（P=0.003）、DCAF7（阴性∕阳性）HR及其95%CI为1.80（1.20，2.81）（P=0.005）是影响结直肠癌病人不良预后的独立危险因素（P＜0.05）。

表4 影响结直肠癌病人预后的危险因素分析

2.7 DCAF7 与miR-589-5p 在NCM460 细胞和SW837 细胞中表达水平比较NCM460 细胞组DCAF7 表达水平为1.02±0.09，miR-589-5p 表达水平为1.01±0.11，与NCM460 细胞比，SW837 细胞中DCAF7 的表达2.62±0.29 升高（t=11.78，P＜0.001），miR-589-5p 的表达0.36±0.06 降低（t=11.60，P＜0.001）。

2.8 各组SW837 中miR-589-5p、DCAF7 表达水平及细胞侵袭能力比较与Control 组比，miR mimic组miR-589-5p 表达显著升高（P＜0.05），DCAF7 表达和侵袭细胞数显著降低（P＜0.05）；与miR mimic 组比，miR mimic+pc-DCAF7组miR-589-5p表达差异无统计学意义（P＞0.05），DCAF7 表达和侵袭细胞数显著升高（P＜0.05），见图4，表5。

表5 结肠腺癌病人各组SW837细胞中miR-589-5p、DCAF7 mRNA表达水平及细胞侵袭能力比较∕

表5 结肠腺癌病人各组SW837细胞中miR-589-5p、DCAF7 mRNA表达水平及细胞侵袭能力比较∕

注：miR-589-5p为微小RNA-589-5p，DCAF7为CUL4相关因子7。①与Control组比较，P＜0.05。②与miR mimic组比较，P＜0.05。

图4 结肠腺癌病人各组SW837细胞侵袭能力比较（结晶紫染色×200）

2.9 DCAF7 与miR-589-5p 靶向关系验证TargetScanHuman 网址 预测DCAF7 与miR-589-5p 间存在结合位点，见图5。双萤光素酶报告基因结果显示：与pmirGLO-DCAF7-wt+mimic NC 组相比0.99±0.12，SW837 细胞萤光素酶活性在pmirGLO-DCAF7-wt miR-589-5p mimic 组0.31±0.03 显著降低（t=12.40，P＜0.001），与pmirGLO-DCAF7-mut+mimic NC组相比0.97±0.11，SW837 细胞萤光素酶活性在pmirGLO-DCAF7-mut miR-589-5p mimic 组0.99±0.14差异无统计学意义（t=0.25，P=0.808）。

图5 结肠腺癌病人CUL4相关因子7（DCAF7）与微RNA（miR）-589-5p结合位点

3 讨论

近年来我国结直肠癌的发病率和死亡率一直在增加［11-12］。尤其是中晚期结直肠癌病人［13-14］。目前，根治性手术是治疗结直肠癌的有效方法，但早期病程隐匿及大多数结肠癌病人就诊时已处于中晚期是病人预后差的主要原因［15］。已证实，一些肿瘤分子与结直肠癌病理特征及预后有密不可分的关系［16-17］。

本研究通过Ualcan 数据库分析表明，结肠腺癌组织中miR-589 表达水平显著低于癌旁组织，DCAF7 表达水平显著高于癌旁组织，且本研究发现结直肠癌组织中DCAF7 阳性表达率及DCAF7 mRNA 相对表达水平较癌旁组织高，miR-589-5p 相对表达水平较癌旁组织低，表明本研究与Ualcan 数据库分析结果一致，提示miR-589-5p、DCAF7 可能对结直肠癌发生有影响。Wu、Zhang［18］通过体外细胞实验显示，miR-589-5p 在肾细胞癌中作为LncRNA 赖氨酰氧化酶如1 反义RNA 1（LOXL1-AS1）分子海绵，高表达miR-589-5p 可抑制肾细胞癌的增殖和迁移，为肾细胞癌的治疗开辟了新方向。Ji等［19］研究显示miR-589-5p 在前列腺癌中下调，低表达miR-589-5p可通过靶向负调节趋化因子配体5而促进前列腺癌细胞的细胞迁移和侵袭。Misir 等［20］通过检索GEPIA 数据库分析表明，乳腺癌组织中DCAF7 阳性表达率明显高于正常乳腺组织。本研究显示结直肠癌组织中miR-589-5p 与DCAF7 表达水平呈负相关，miR-589-5p、DCAF7 均与淋巴结转移、肿瘤浸润深度相关，提示miR-589-5p 可能与DCAF7 共同影响结直肠癌病情进程。本研究发现miR-589-5p 高表达组病人平均生存时间显著长于miR-589-5p 低表达结直肠癌病人，DCAF7 阴性表达病人平均生存时间显著长于DCAF7阳性表达病人，miR-589-5p 低表达、DCAF7 阳性是影响结直肠癌病人不良预后的独立危险因素，提示miR-589-5p、DCAF7 可能影响结直肠癌预后不良发生，有作为结直肠癌预后新分子标志物的潜力。本研究经过细胞学实验证实，SW837 细胞中miR-589-5p 表达下调，DCAF7 表达上调，与miR-589-5p、DCAF7 在结直肠癌组织中研究结果一致，还证实miR-589-5p 与DCAF7 存在靶向关系，miR-589-5p 高表达抑制SW837 细胞侵袭，DCAF7 高表达可逆转miR-589-5p高表达对SW837 细胞侵袭的抑制作用，表明miR-589-5p 高表达可能通过抑制DCAF7 表达来抑制SW83细胞的侵袭。

综上所述，结直肠癌组织中miR-589-5p 呈低表达、DCAF7 呈高表达，与结直肠癌淋巴结转移、肿瘤浸润深度以及预后不良独立危险因素，有望成为结直肠癌治疗的新分子标志物。但本研究尚未深入探讨miR-589-5p、DCAF7 与结肠癌预后不良病理机制的关系，仍需深入探讨。

（本文图1～4见插图6-10）