血液透析、腹膜透析患者预后与肠道菌群的相关性分析

张 红,丁涵露,2,陈 瑾,2

(1.西南医科大学附属医院临床医学院,四川 泸州 646000;2.四川省医学科学院·四川省人民医院,四川 成都 610072)

慢性肾脏病是指多种原因导致的慢性肾脏结构和功能障碍(肾脏损害病史大于3个月),其中包括肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)正常和不正常的病理损伤、血液或尿液成分异常,及影像学检查异常,或不明原因GFR<60 ml/min·1.73m2超过3个月。中国慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患病率为10.8%[1]。CKD 5期的患者采用肾脏替代治疗,但研究表明,在治疗期间依然存在毒素潴留的问题[2]。肠道菌群是一个具有营养和保护功能的动态共生生态系统,与宿主的代谢系统保持着持续的相互作用。病理情况下,肠道菌群的失衡,某些细菌过度生长,慢性激活免疫系统,从而引发疾病[3.4]。透析患者和健康对照组的肠道菌群在组成和功能存在差异,然而这些结果并不一致[5-8]。本研究比较了血液透析(hemodialysis,HD)、腹膜透析(peritoneal dialysis,PD)患者和健康对照者的肠道菌群差异,并进行了肠道菌群与透析患者预后相关性分析。

1 资料与方法

1.1 一般资料纳入2005年1月至2022年6月在四川省人民医院随访的患者63例。纳入标准:在四川省人民医院随访的HD及PD患者,治疗时间大于3个月。排除标准:①合并恶性肿瘤、肝硬化、肠手术、肠易激综合征的患者;②标本采集前1周使用益生菌、益生元或抗生素;③孕妇或肾移植受者;④素食者或纯素食者的患者。本研究经我院伦理委员会审核通过(编号:2018195),并由患者签署临床标本收集检测知情同意书。依据患者的治疗模式分为PD组27例、HD组36例。对照组为2018年6月至2022年6月于四川省人民医院体检中心体检的健康人群57例。所有患者随访至2022年6月或患者死亡或失访结束。

1.2 方法

1.2.1一般资料采集 收集患者人口学资料,包括开始腹透时的年龄、性别、CKD的原因。血红蛋白、血浆白蛋白、尿素、血清肌酐、尿素氮、甘油三酯、胆固醇、估算肾小球滤过率。

1.2.2粪便样本收集 在粪便标本采集前7天,禁止使用益生菌或食用酸奶。保持粪便中部均匀部分约1克,避免食物残留。将粪便收集到收集管中,4小时内放入-80 ℃冰箱中。女性避免进行生理周期取样。

1.2.3肠道菌群检测 对DNA样本进行定量,并选择16S rRNA的V3-V4高变区进行PCR扩增。使用Trimmomatic(v 0.36)得到原始数据,然后用FLASH软件(v1.2.11)拼接双端序列,要求序列重叠至少10 bp,采用滑动窗口法对序列做质量过滤,去除接头污染和低质量数据,将重叠的成对端读数合并到标签中(标签与OTU的序列相似性为97%),使用核糖体数据库给OTU代表序列分配分类等级。最后,基于OTU和分类等级进行α多样性、β多样性以及不同物种的筛选进行了分析。

1.3 统计学方法使用SPSS 26.0统计软件包进行数据分析。正态分布计量资料用均数±标准差表示,偏态分布计量数据以中位数(四分位间距)表示,三组以上比较采用ANOVA检验,多重检验采用Bonferroni分析。采用非参数检验(Mann WhitneyU检验或Kruskal-Wallis) 对非正态分布的参数进行分析。计数资料以百分率表示,比较采用卡方检验。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组临床资料比较HD组共36例(其中死亡2例,失访3例),男18例,女18例,年龄(53.89±14.08)岁;PD组27例(其中死亡2例,失访1例,5例转为肾移植,6例转为HD),男19例,女8例,年龄(52.26±14.29)岁;57例为健康对照组,男31例,女26例,年龄(54.89±5.33)岁,3组患者年龄、性别比较差异无统计学意义(均P>0.05),而HD与PD组的血肌酐、血尿素氮、血尿酸值显著升高(均P<0.001)。对照组的BMI、胆固醇高于HD组与PD组(P<0.05)。PD组的甘油三酯高于HD组及对照组(P=0.008)。见表1。

表1 PD组、HD组与对照组的一般资料比较

2.2 肠道菌群类别分析如图1所示,不同颜色代表不同组,每个圆圈内的数字表示各组中的OTU数量,重叠区域表示各组中的共同OTU集合。三组所共有的OTU数为645,血透组、腹透组、对照组的OTU数分别为916、727、1405,其中透析组的OTU数明显低于对照组,腹透组与血透组之间差距不大PCA构建二维图(图2),显示血透组及腹透组与对照组之间距离较远,第一主成分的贡献为12.04%,第二主成分的贡献为8.98%。

图1 不同组别之间的Venn图

图2 不同组别OTU丰度的主成分分析

2.3 组及组间α多样性分析健康对照组与透析患者相比,Sobs、Chao、Ace、Shannon指数显著升高,差异有统计学意义(P均小于0.05)。说明健康对照组的群落均匀性和物种的多样更高,而PD组与HD组的物种丰度无明显差异。见表2。

2.4 各组肠道菌群多样性及门、属水平的分类分布根据不同分类等级(门、纲、目、科、属)的物种组成比例情况可以看出,从门水平上看(图3),各组主要由拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭状菌门组成,其中对照组还有一定比例的放线菌门,血透组中存在一定量的疣微菌门。在属水平上(图4),对照组中的双歧杆菌、普雷沃特拉菌与另外两组比较增多,拟杆菌属减少。HD组的粪球菌属和普雷沃特拉菌低于对照组、PD组,拟杆菌属增高。PD组的瘤胃球菌属增高。

图4 各组在属水平上的相对丰度

2.5 肠道菌群与预后相关性分析通过显著性分析发现,HD组中2例死亡病例普雷沃特拉菌减少。PD组中2例死亡,其在门水平主要为拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭杆菌门,属水平上萨特氏菌、瘤胃球菌属增高,普雷沃特拉菌、埃希菌属、土里西杆菌减少。危险因素分析显示普雷沃特拉菌是影响透析患者预后死亡的危险因素(P=0.047)。见表3。Spearman相关性分析显示普雷沃特拉菌与患者生存时间负相关性(r=-4.18,P=0.001)。

表3 影响透析患者预后的危险因素分析

3 讨论

HD和PD都能去除体内多余的水分以减少容量负荷,清除代谢废物(如肌酐、尿素氮和其他小分子毒素),并维持电解质和酸碱平衡。这些都是影响肠道微生物的因素。但是,几乎没有研究证明HD和PD患者肠道微生物区系的影响。本研究比较了PD和HD患者与健康对照者肠道菌群差异,并且分析了与PD和HD组患者预后相关的肠道菌群。

研究观察到门水平上各组主要由拟杆菌门、厚壁菌门、变形菌门、梭状菌门组成。对照组的放线菌门升高,HD、PD患者的拟杆菌门增高。属水平上,对照组中的双歧杆菌、拟杆菌属、普雷沃特拉菌增多,HD组中的小杆菌属、粪球菌属减少。PD组中死亡的2例萨特氏菌、瘤胃球菌属增高,普雷沃特拉菌、埃希菌属、土里西杆菌减少;转为血液透析的6例患者考拉杆菌属、链球菌属增高,土里西杆菌减少。HD组中死亡的2例优杆菌属、链球菌属增高,普雷沃特拉菌、颤螺菌属、土里西杆菌减少。

CKD患者肠道微生态肠道菌群失调常表现为菌群种类、相对丰度及其代谢产物改变[8]。目前已经有许多研究将肠道菌群变化与CKD的发病机制联系起来。终末期肾病患者尿毒症毒素聚集,肠道环境改变,肠道中普氏杆菌减少,拟杆菌增多[9]。这与本研究结果相似。血液透析在超滤过程中维持血流动力学稳定的代偿机制下内脏血流量的减少可能会导致肠道低灌注,从而破坏肠道屏障,增加细菌易位的风险。Wang等发现CKD5期的患者肠道内双歧杆菌减少,慢型埃格特氏菌增多[10]。另一项对73名受试者进行的临床研究发现,CKD患者和对照组之间存在31个系统类型的差异[11]。研究显示与非透析的CKD患者相比,HD可以改善肠道微生物区系紊乱,包括增加双歧杆菌和嗜酸乳杆菌,减少大肠杆菌和粪肠球菌[5]。Luo等的研究发现PD对CKD患者肠道菌群没有显著影响[6]。相比之下,Hu等的研究比较了PD、HD、非透析CKD和健康对照组的肠道微生物区系,并报道了PD降低了微生物多样[7]。此外,本研究观察到各组的梭状菌门有所升高。肠道微生物群受到不同环境、饮食和生活习惯的影响,并且受到患者依从性的影响,这可能解释产生差异的原因。

本研究表明普雷沃特拉菌与患者生存呈现负相关。由于培养的局限性,普雷沃特拉菌与其他属相比受到的关注较少。普雷沃特拉菌属于革兰氏阴性厌氧菌,是口腔中最具优势的属之一,同时也在人类的皮肤、阴道和胃肠道中被发现。其与多种疾病有关,包括炎症性自身免疫性疾病、机会性感染、细菌性阴道病以及口腔生物膜形成和疾病。相反,另一项研究发现普雷沃特拉菌与胰岛素抵抗有关,而较低基线水平的普雷沃特拉菌与超重个体在地中海饮食干预后胰岛素抵抗的降低有关[12]。感染中最常见的是口腔感染,报告最多的是牙周感染和牙髓感染,肌肉骨骼、头颈部、下呼吸道和皮肤感染少见,此外,口腔感染也可能导致继发性全身感染或与器官相关的感染[13]。研究表明,在关节炎小鼠中普雷沃特拉菌通过扩大肠属Allobaculum、增加丁酸盐产量来预防关节炎[14]。除此之外,普雷沃特拉菌可通过调控宿主NF-κB/C-myc影响育龄妇女持续人类乳头瘤病毒感染和宫颈病变的发生[15]。在克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中,普雷沃特拉菌和产黑素假单胞菌的丰度显著增加,因此普雷沃特拉菌被认为是与克罗恩病相关的一个潜在标志[16]。Yang等的研究发现普氏外膜蛋白负责Th17的发展、激活以及IL-17B和IL-17A的表达,最终促进肺纤维化, 这些结果表明共生普氏杆菌不仅加重了呼吸道免疫反应,而且能够调节病原诱导的免疫反应[17]。目前普雷沃特拉菌在慢性肾脏病中的作用机制尚不明确。

本研究的优势为观察了肠道菌群与CKD患者的预后关系,反映了四川地区CKD患者的肠道菌群变化。本研究尚存在有一定的局限性:首先,它是一个有地域限制的单中心研究。其次,本研究在样本收集时是依据患者自愿入组的原则,没有进行随机分组。但本研究显示了不同透析治疗模式的CKD患者肠道微生物多样性和群落变化,发现了肠道菌群变化与患者生存的相关性。在此基础上,我们将针对普氏菌属与CKD的关系深入研究,为通过调节肠道菌群防治CKD的治疗提供依据。