胶体金免疫层析法在豇豆农药残留检测中的应用

◎ 潘喜芳，黄全书，施显超，黄 霞，温 娜，钟英海，钟昌宇

（1.广西壮族自治区钦州市农产品质量安全检测中心, 广西 钦州 535099；2. 广西壮族自治区钦州市钦北区农业农村局，广西 钦州 535000；3. 广西壮族自治区钦州市浦北县农产品质量安全检测站，广西 钦州 535399；4. 广西壮族自治区钦州市钦南区农产品质量安全监测管理站，广西 钦州 535099）

豇豆又名菜豆、蕃豆，属茄科豇豆属，原产南美洲秘鲁和智利，我国各地均有栽培。近年来，我国对豇豆的研究十分重视，不仅在生产上大力推广应用豇豆品种、肥料配方与技术、农药科学使用技术等方面的研究成果，而且在科学管理措施下提高了种植效益。但由于环境因素和管理措施等影响，豇豆中一些农药残留污染问题日趋严重。对豇豆中农药残留的研究主要集中在生产加工环节、使用过程及残留检测方法方面，对于使用的农药在豇豆中是否存在高含量的残留以及检测技术等研究较少。同时，国内外对豇豆农药残留的检测技术很少报道，在实际检测中也难以保证豇豆农药残留的准确性。因此，迫切需要加强豇豆中农药残留分析的研究。

近年来，广西壮族自治区农业农村厅持续加大对豇豆的农药残留监测力度。2015 年开始连续7 年要求各地市开展豇豆专项抽检，采用定量法检测甲胺磷、灭多威、毒死蜱等13 种农药，2017 年增加氟虫腈、啶虫脒、苯醚甲环唑、烯酰吗啉等29 种农药。2022 年，农业农村部开始将豇豆列为例行监测必抽品种，将吡唑醚菌酯、甲维盐、灭蝇胺等常规农药和克百威、三唑磷、乙酰甲胺磷等禁用农药作为必检参数，并把豇豆农残治理工作作为食品安全评议考核重点。《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）规定最大残留限量，克百威在豇豆上的限量值为≤ 0.02 mg·㎏-1，乙酰甲胺磷在豇豆上的限量值为≤ 0.02 mg·㎏-1，三唑磷在豇豆上的限量值为≤ 0.05 mg·㎏-1，吡唑醚菌酯在豇豆上的限量值为≤ 0.02 mg·㎏-1，灭蝇胺在豇豆上的限量值为≤0.5 mg·㎏-1，甲氨基阿维菌素苯甲酸盐在豇豆上的限量值为≤0.015 mg·㎏-1，氧乐果在豇豆上的限量值为≤0.02 mg·㎏-1，毒死蜱在豇豆上的限量值为≤0.5 mg·㎏-1，啶虫脒在豇豆上的限量值为≤ 0.2 mg·㎏-1。

目前，现行有效地广泛应用在我国新鲜果蔬中农药残留检测的定性检测方法分为酶抑制法和纸片法，检测技术标准为GB/T 5009.199—2003，这2 种速测法只能进行有机磷类和氨基甲酸酯类检测[1]。钦州市农产品质量安全检测中心尝试使用胶体金免疫快检技术快速检测方法检测豇豆中的克百威、乙酰甲胺磷、吡唑醚菌酯、灭蝇胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐等9 种农药，通过对其结果准确性进行测定和评价（依据农业农村部和农业农村厅例行监测和风险评估等结果），并同三重四级杆液相-质谱联用仪结果进行对比分析，以解决农安监管难题。

1 材料与方法

1.1 实验材料

豇豆；克百威、乙酰甲胺磷、三唑磷、吡唑醚菌酯、灭蝇胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氧乐果、毒死蜱、啶虫脒9 种农药标准溶液（天津农业部环保科研监测所）。

1.2 仪器设备

克百威、乙酰甲胺磷、三唑磷、吡唑醚菌酯、灭蝇胺、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐、氧乐果、毒死蜱、啶虫脒9 种农药胶体金免疫层析速测卡；涡漩振荡器，三重四级杆液相-质谱联用仪（岛津LCMS8040）；乙 腈(HPLC，Tedia Company)， 甲 醇(HPLC，Tedia Company)， 乙 酸 铵(LC-MS 级，CNW Technologies)，氯化钠、无水甲酸(LC-MS 级，天津市光复科技有限公司)，超纯水(Millipore 超纯水机制备)，微孔滤膜(0.22 μm，Agela Technologies），QuEChERS 净化管[50 mg PSA+150 mg MgSO4，岛津技迩（上海）贸易有限公司]。

2 检测方法

2.1 胶体金免疫层析法

检测原理：采用竞争抑制免疫层析原理。首先，提取样品中的农药，将其与胶体金标记的特异性抗体结合；然后，抑制抗体和试纸中检测线（T 线）上的抗原结合，从而产生检测线颜色深浅的变化。通过对检测线与控制线（C 线）颜色深浅进行比较，即可对样品中的农药进行定性判断[2]。

2.2 定量分析

2.2.1 样品前处理

准确称取25.00 g(精确至0.01 g)匀浆后的豇豆样品于100 mL 离心管中，加入50 mL 乙腈，5 ～7 g NaCl，用高速分散机以12 000 r·min-1均质提取2 min，以8 000 r·min-1高速离心5 min；吸取上清液1.5 mL置于QuEChERS 净化离心管（50 mg PSA+150 mg MgSO4）中涡旋1 min，100 000 r·min-1离心5 min；取上清液过0.22 μm 滤膜，滤液待测。

2.2.2 色谱-质谱条件

色谱条件：SHIMADZUC18 柱子，色谱柱(φ1.9 μm，2.1 mm×100 mm)；柱温：40 ℃，流速0.2 mL·min-1；进样量1 μL；流动相A 为0.5 mmol·L-1醋酸铵+0.01%甲酸水溶液，流动相B 为乙腈；洗脱方式：梯度洗脱，有机相初始浓度为10%，4 min 有机相浓度50%，15 min 设置75%，17 ～20 min 设置95%。

质谱条件：电喷雾离子化离子模式（ESI）；扫描模式：多反应监测(MRM)扫描方式；离子源接口电压：ESI+，+4.5 kV；ESI-，-3.5 kV；雾化气：氮气3 L·min-1；干燥气：氮气15 L·min-1；碰撞气：氩气；DL 管温度：250 ℃；加热模块温度：450 ℃；对9 种农药单标溶液进行质谱参数优化，确定特征母离子和子离子。

3 实验过程与结果分析

3.1 具体操作过程

制作3组样品A、B、C，根据不同生产厂家（北京勤邦、广州食源生物、美正生物）的胶体金检出限值，对各组样品添加不同浓度的标准物质（0.02 ～2.00 mg·kg-1），每组样品设置3 个平行样，分别为A1、A2、A3；B1、B2、B3；C1、C2、C3。将不同生产厂家的胶体金试纸检测结果与液质联用仪定量分析结果进行比对。

3.2 胶体金免疫层析法结果分析

表1 为三重四级杆液相-质谱联用仪定量检测结果。结果显示，3 家公司生产的胶体金免疫层析速测卡检测豇豆上的克百威、乙酰甲胺磷、三唑磷等9 种农药在检出限范围内大多数都显示阴性，超过检出限范围的显示阳性，与液质联用仪定量检测结果一致或者相似，偶尔出现假阴性。此方法具有准确性高、针对性强，检测条件受环境影响较小、检测时间短等优点，可以基本满足《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》 (GB 2763-2021)中规定的果蔬农药残留最大残留量要求。

表1 三重四级杆液相-质谱联用仪定量检测结果表（mg·kg-1）

4 结论

农药残留检测方法是评价农产品质量安全水平的重要指标之一，但目前许多检测方法还存在一些不足。目前，我国已制定了30 多个农药残留标准，但不同地区、不同环境中的残留农药标准不统一且没有相互衔接，这就导致了农药的使用不能做到科学合理。另外，在豇豆生产中，由于种植方式的差异、豇豆病虫害发生复杂多样等原因，部分种植者为了追求高产高效，违规使用有毒有害的农药，造成环境污染严重。因此，应建立适用于豇豆等农产品生产经营和销售的残留农药检测标准规范，从而保障豇豆生产安全和食用安全。由于我国对农产品中残留农药检测技术尚缺乏成熟完善的经验。因此，要建立适用于豇豆种植和销售过程中残留农药检测标准规范，就需要充分考虑该农产品在生产经营、市场销售过程中的各种环境条件，以及在这些环境条件下所产生的残留农药种类、含量等方面因素的影响，这样才能使这些方法更好地为农业生产实践服务。

目前，国内农业技术推广及农产品质量安全监管部门、市场监管部门、批发市场快速检测室等使用的农药残留速测仪，主要针对有机磷类和氨基甲酸酯类农药[3]，但是无法检测菊酯类农药残留。胶体金免疫层析技术检测快速、简便、特异性强、灵敏度高，能满足国家食品安全标准[4]。在已知施药情况的果蔬农产品生产基地中，果蔬上市采摘前可以对相关农产品进行半定量检测[5]，此类快速检测产品的方法适合在基层农产品质量安全监管中推广应用，适用于豇豆的种植和销售过程中，农药残留检测标准规范的建立及推广应用。