超高效液相色谱- 串联质谱法测定鱼肉中4 种四环素类抗生素

王雪蓉，杨燕红，杨 丽，陈大鹏，马义虔

贵州省产品质量检验检测院，贵阳 550016

四环素类(tetracyclines, TCs)药物是由放线菌产生的一类基本骨架为并四苯环的广谱抗生素[1-2]。四环素类药物在水产养殖领域具有广泛的应用[3]，它对病原菌有抑制作用，也能促进水产动物快速生长。由于缺乏科学指导，导致滥用现象十分严重，在水产养殖过程中会有20%～30%的四环素类药物被鱼类吸收，从而诱导体内致病微生物产生抗性基因(antibiotic re sistance genes，ARG)，当抗性基因通过食物链方式进入人体后会对健康构成威胁[4-6]。四环素类抗生素是保障动物和人类健康的重要武器，如果长期食用含四环素类抗生素残留的水产品，可能会产生致癌致畸致突变、过敏反应和降低人体免疫能力的危害等[7-8]。因此，世界各国对水产品中的兽药残留限量做了严格规定，我国规定鱼组织（皮和肉）中土霉素、金霉素和四环素的最大残留量为200 μg/kg[9]。

四环素类抗生素的检测方法有：微生物法[10]、免疫分析法[11]、分光光度法[12]、高效液相色谱法[13]和液质联用法[14-17]等。微生物法只能测定四环素类抗生素总量，酶联免疫法只能测定个别四环素类抗生素[13,18]，高效液相色谱-串联质谱法灵敏度高、准确度高，且仪器分析时间短，适用于多种抗生素药物残留的同时分析。本研究使用Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液提取，Oasis HLB 固相萃取小柱净化，结合UPLCMS/MS 测定鱼中4 种四环素类（四环素、金霉素、土霉素、强力霉素）抗生素的方法，为鱼肉中四环素类抗生素的测定提供一种准确、可靠的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

AcQuity H/Xevo TQ-XS 液相色谱质谱联用仪，Waters 公司；H1850 离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；MultiReax 涡旋振荡器，Heielolph公司；Chorusl 超纯水系统，英国Elga；ME1002TE 电子天平，德国Mettler。

1.2 材料与试剂

柠檬酸、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠、盐酸、氢氧化钠、醋酸铅、甲酸、甲醇、乙酸乙酯、乙腈均购买于国药试剂。

标准品：盐酸金霉素、盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸多西环素，纯度均≥95%。

Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液(0.1 mol/L)：取乙二胺四乙酸二钠37.2 g、柠檬酸12.9 g、磷酸氢二钠10.9 g，加水溶解并定容至1 000 mL，用HCl 或NaOH调pH 值至4.0±0.05。醋酸铅溶液(20.0 g/L)：取醋酸铅20.0 g，加水溶解并定容至1 000 mL。甲醇-乙酸乙酯：取甲醇10 mL、乙酸乙酯90 mL，摇匀。0.1%甲酸溶液-乙腈：取0.1%甲酸溶液90 mL、乙腈10 mL，摇匀。

1.3 试验方法

1）标准溶液的配制。①4 种抗生素单标储备液配制：准确称取4 种抗生素标准品用甲醇定容至10 mL，配制成质量浓度为1 000.0 μg/mL 单标储备液。

②4 种抗生素混标中间液配制：分别移取0.1 mL 4 种四环素类抗生素储备液于容量瓶中，用甲醇定容至10 mL，配制成10 μg/mL 混标中间液。

③4 种抗生素混标使用液配制：分别吸取0、2、5、10、20、50、100 μL 混标中间液，用空白基质溶液定容至10 mL，配制0、2、5、10、20、50、100 ng/mL 的混标使用液。

2）样品前处理。

①样品制备：鱼肉样品切碎，用均质仪捣碎均质，混匀后，四分法取样。

②提取：称量2 g 样品于离心管中，加Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液6 mL、醋酸铅溶液2 mL，涡旋混匀2 min，超声提取20 min，4 ℃条件下8 000 r/min 离心5 min，取上清液。重复提取2 次，合并3次提取液。

③净化：Oasis HLB 固相萃取柱依次用甲醇、水各5 mL 进行活化，取提取液10.0 mL 过柱，过完后用水、甲醇溶液各5 mL 淋洗小柱，弃去流出液，减压抽干5 min。甲醇-乙酸乙酯5 mL 洗脱，洗脱液于40 ℃下氮气吹至近干，加0.1%甲酸溶液-乙腈1.0 mL 溶解残渣，涡旋混匀，过0.22 μm 滤膜，待测。

3）液相条件。色谱柱：ACQUITY UPLCRBEH C18 (2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流速：0.35 mL/min；进样量：1 μL；柱温：40 ℃；流动相：A 为0.1%甲酸水，B 为乙腈；梯度洗脱程序见表1。

表1 四环素类的流动相梯度洗脱

4）质谱条件。电离方式：电喷雾ESI；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测(MRM)模式；雾化气流速：1 000 L/h；锥孔气流速：150 L/h；脱溶剂气流速：200 L/h；毛细管电压：4 200 V；离子源温度：350 ℃；质谱条件见表2。

表2 质谱条件

2 结果与分析

2.1 线性方程和检出限

本试验采用添加空白基质溶液对4 种混标溶液进行定量测定。4 种四环素类混合标准溶液的定量离子MRM 色谱见图1。

图1 四环素类抗生素混合标准溶液的MRM 色谱（质量浓度10 ng/mL）

由表3 可知：4 种四环素类（四环素、金霉素、土霉素、强力霉素）抗生素在0～100 ng/mL 范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。

表3 四环素类抗生素线性方程和相关系数

2.2 方法回收率和精密度

选取阴性的鱼肉样品，分别加入3 个水平（5.0、10.0、50.0 μg/kg）的四环素类抗生素标准溶液，按照本文“1.3”中的条件进行加标回收试验，结果见表4。由表4 可知：多西环素、土霉素、四环素、金霉素的回收率范围分别为85.6%～97.7%、89.3%～93.0%、84.2%～97.1%、87.6%～94.2%，精密度RSD 范围分别为0.9%～1.3% 、0.2%～1.7% 、0.4% ～7.5% 、1.0% ～1.2%。研究表明，4 种四环素类抗生素回收率均在70%～120%，相对标准偏差RSD≤10%，满足GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》对回收率60%～120%、精密度＜15%的要求，说明该方法具有较好的准确性和稳定性，可以用于鱼肉中四环素类抗生素的测定。

表4 四环素类抗生素的回收率和精密度

2.3 方法检出限

方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ)为产生3 倍和10 倍信噪比(S/N)时磺胺类化合物的质量浓度。四环素类抗生素检出限为5.0 μg/kg，定量限为10.0 μg/kg，而国标GB 31656.11—2021《食品安全国家标准 水产品中土霉素、四环素、金霉素和多西环素残留量的测定》中多西环素、土霉素、四环素、金霉素的检测限分别为20.0、10.0、10.0、20.0 μg/kg，定量限分别为40.0、20.0、20.0、40.0 μg/kg，表明该方法的4 种四环素类抗生素的检出限和定量限均低于国标给定值，可以测定出更低浓度的含四环素类抗生素样品。

2.4 样品测定

2022 年采用该方法对45 批次鱼肉样品进行测定，检出四环素3 批次和金霉素4 批次，含量范围分别为10.20～30.34、15.60～41.87 μg/kg，GB 31650—2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定四环素和金霉素限量值为100 μg/kg，所有样品均在限量值范围内，说明这45 批次鱼肉样品不会对消费者身体健康带来危害。

3 结 论

鱼肉中四环素类药物的检测对人类的健康非常重要，本研究建立了鱼肉中4 种四环素类抗生素（四环素、金霉素、土霉素、强力霉素）的超高效液相色谱-串联质谱测定方法。以Na2EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液提取、Oasis HLB 固相萃取小柱净化，通过加标回收率试验表明：回收率均在70%～120%、相对标准偏差RSD≤10%，4 种四环素类抗生素检出限均为5.0 μg/kg，定量限为10.0 μg/kg，满足GB/T 27404—2008 对回收率60%～120%、精密度＜15%的要求，说明该方法灵敏度高、准确性高和稳定性好，可用于鱼肉中4 种四环素类药物的测定。