探讨外周血循环肿瘤细胞形态学分析技术在肿瘤临床检验中的应用价值

于欣,于霜,殷晓伟,杨玉柱（山东省单县中心医院,山东 菏泽 274300）

在临床现代各项医学技术逐步改进和推广的背景下，无创循环肿瘤细胞（CTC）检测方式的特异性和敏感性不断提升[1]，并在临床得到了更多的应用和更大的关注度。VONA学者在2000年时，首次通过健康血液细胞形态和大小，用显微镜方式观察外周血状况，进而检出CTC[2]。此项技术能完整显示出CTC各表型，并具备成本低、便捷、快速等优势，利于后续开展研究和实验。当前主流技术中，免疫学技术在肿瘤标志广谱检测和特异性方面存在一定缺陷，会导致无法检出异质性CTC，而ISET技术缺陷为部分较大单核细胞易混淆在CTC中[3]，而部分较小CTC则易经过滤而在检测中出现漏检的状况。所以，现在暂无完美的检测方式能完整捕捉到循环内CTC。在鉴定CTC方面，仍然主要采用免疫学技术，但此方式具备标志物特异性缺陷，逆转录-聚合酶链反应（PCR）技术具备较高灵敏度，但无法更为完整地观察到细胞，而在形态学方法上则具备成本低、直观、快速等优势[4]。本研究利用我国相关部门认可的CTCBIOPSY异常细胞分离染色系统，纳入2020年2月-2021年12月单县中心医院收治的120例肿瘤患者，归类常见肿瘤患者外周血检出CTC状况，并分析此类基于ISET技术和形态学评估标准的CTC方式应用到临床肿瘤检验中所具备的价值。具体报告如下。

1 资料及方法

1.1一般资料 选取2020年2月-2021年12月单县中心医院收治的120例肿瘤患者作为研究对象，包含前列腺癌21例、乳腺癌25例、肠癌21例、肺癌53例；疾病TNM分期：I期24例、II期29例、III期30例、IV期37例；年龄34-78岁，平均为（58.65±1.02）岁；女性58例、男性62例。120例患者基本资料均满足本研究各项条件和标准。各患者均接受首次手术后经病理检查得到确诊，排除以往接受相应医疗治疗者、肝肾心肺功能性疾病者、精神/智力异常者。

1.2方法 采集各患者接受治疗前肘静脉血液4ml，将血液标本置入含乙二胺四乙酸抗凝（EDTA）的真空采血管中，防止采血中出现上皮细胞污染，用第2管血液标本进行CTC检测。完成采血后，上下摇动混匀采血管，充分混合抗凝剂和血液标本，采集血液标本后2h内则需进行检测。

标本前处理：用医用乙醇75% 1ml润洗滤器、NaCl 0.9% 2ml溶液进行漂洗。将0.9% NaCl溶液3ml和固定剂（PFA 8%）200uL加入至15ml的离心管中，均匀混合后，再加入血液标本5ml，均匀混合后，在室内温度下放置10min，再把标本加入到滤器内，用异常细胞分离染色仪（CTCBIOPSY，武汉友芝友公司提供）进行检测。完成分离后，把滤器取出，加入甲醇300uL至滤器中，在室温下固定1min后，把滤膜取出，再把滤膜贴在玻片中间位置，室温下将其晾干后，实施染色处理，50℃环境下干燥30min，滴入甘油100%进行封片处理，再实施免疫组化镜检。

1.3指标判定 油镜观察，评估富集细胞形态[5-6]：①细胞核异型性，表现为分叶状、结节状，呈不规则形状；②细胞长端（直径）高出15um；③核质比高出0.8；④核着色不均匀且深染；⑤核膜增厚，表现为皱褶或凹陷，核膜形状为锯齿状；⑥细胞核核仁巨大或染色质边移，或出现异常核分裂状况。评估标准：①CTC：满足以上参数项目≥4个；②除⑥以外的项目，任意满足3个或单一满足评估参数⑥则可判定其为疑似CTC；③细胞成团数目≥3个，则可判定为CTC，但因互相重叠或连接，则无法准确评估为CTC细胞团，则将其判定为循环肿瘤微栓（CTM）[7]；④≥3个细胞成团，无法判定为CTC细胞团，则评估呈疑似CTM[8]；⑤无法评估来源为血液的细胞，但也不满足以上各类型的细胞，则标记非血液细胞[9]。

本研究各患者标本检验均由医院2名影像学科专业医生负责，若产生意见分歧，则根据判定标准商讨确定结果。

1.4统计学方法 用R软件（3.5.0版本）分析数据，数据正态分布下用t检验（±s），偏态分布的连续变量用中位数表示，Mann Whitney U检验；χ2检验分类变量，秩转换等级变量后，再实施Mann-Whiney U检验，若P＜0.05，则表示有统计学意义。

2 结果

2.1外周血CTC形态学检出状况 此次120例肿瘤患者，共49例检出CTC（40.83%），9例检出CTM。通过进一步检验CD31、CD45抗体实施免疫组化验证，显示49例存在CTC形态的患者和9例CTM患者检出的CD31、CD45均为阴性，满足CTM、CTC免疫学特征。

2.2CTC阴性组和阳性组各参数比较 CTC阳性组CTC计数、年龄高于CTC阴性组，CTC阳性组T4分期率51.02%高于CTC阴性组T4分期率8.45%，T2分期率16.33%、T1分期率4.08%、T0分期率0%低于CTC阴性组T2分期率26.76%、T1分期率35.21%、T0分期率1.41%；CTC阳性组N3分期率32.65%、N2分期率20.41%高于CTC阴性组的8.45%、12.68%，组间数据有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 CTC阴性组和阳性组各参数比较

2.3各肿瘤疾病中CTC检出状况 CTC阳性组中前列腺癌率52.38%、肺癌率45.28%、肠癌率47.62%、乳腺癌率16%，见表2。

表2 各肿瘤疾病中CTC检出状况

3 讨论

本研究采用ISET形态学方式共检出120例肿瘤患者CTC阳性49例。为深入分析此形态学CTC方式的特异性，此次检测CD31抗体免疫组化类似CTM或CTC的血管内皮细胞，证实CTC检测假阳性率。在染色处理细胞核时采用苏木素染色，细胞膜为棕黄色，即CD31或CD45为阳性，为血管内皮细胞或血液细胞[10]。而细胞核染色为苏木素，细胞膜附近未出现棕黄色，则CD31或CD45为阴性，表现为CTM或CTC。利用免疫组化方式得到证实，经本形态学方式检出CTM和CTC细胞，均满足CD31、CD45的免疫学特征，则提示CTC形态方式和评估标准之间的特异性较高。

同时，由本研究表2 可知，C T C 阳性组中前列腺癌率52.38%、肺癌率45.28%、肠癌率47.62%、乳腺癌率16%，组间差异显著（P＜0.05）。有报告称，同一种肿瘤疾病，其检测方式不同，CTC特异性、敏感性也存在差异。如针对肺癌患者，Cellsearch方式检出CTC患者占比达19%-39%，而ISET方式则显示36%-50%的患者存在CTC[11]。目前，暂未发现具有特异性的肿瘤细胞靶标，最具代表性的则为Cellsearch技术，但如果肿瘤细胞出现上皮间质转化，则无法检出CTC[12]。相比于免疫亲和吸附技术，此次采用的方式能降低肿瘤细胞上皮间质转化中表面标志物改变的影响，进而增强CTM和CTC检出效率。

综上所述，临床通过测得CTC结果，能确保细胞完整性，对临床快速评估各类型肿瘤CTC有积极意义，虽然检测方式在敏感性方面无明显优势，但其特异性较为理想。