叶面喷施硒对紫色小麦镉积累的影响

余林科，杨昕玥，徐小逊，2*，王贵胤，2，杨占彪，张世熔，2

（1.四川农业大学环境学院，成都 611130；2.四川省土壤环境保护重点实验室，成都 611130）

镉（Cd）是土壤重金属污染元素之一，随着工农业加速发展，大量含Cd废物通过工业废气沉降、废水排放、化肥施用等方式进入农业土壤[1]。土壤中过量的Cd 会破坏植物细胞结构，抑制植物的光合作用以及对养分的吸收和运输，进而影响植物的正常生长[2]。此外，Cd 的流动性很强，极易通过植物富集作用进入食物链，对人体健康构成威胁[3]。小麦作为最主要的粮食作物之一，在世界范围内被广泛种植，因此，开发降低小麦Cd污染风险的技术措施很有必要。

减少作物Cd 积累的途径主要包括种植低Cd 积累品种[4-5]，采取改良灌溉方式、施用功能性肥料、叶面喷施阻控剂等农艺措施[6-7]，以及施行土壤改良措施[8-9]等。叶面喷施阻控技术具有操作方便、效率高、环境友好等特点，是一种具有良好应用前景的减Cd措施，已成为当下研究的热点[10]。其中，叶面喷施硒（Se）被认为是缓解作物中Cd 污染毒性效应的有效农艺措施[11]。Se 能够通过与Cd 形成复合物、促进Cd 的螯合作用以及区室化分布等方式，减少植物对Cd 的吸收和转运[12]。研究发现，施Se 可以改变Cd 在植物亚细胞组分中的分布，通过增加Cd 在小白菜和水稻幼苗可溶性组分中的分布比例来降低Cd 的流动性[13-14]。然而庞晓辰等[15]发现施Se 增加了Cd 在水稻K优818细胞壁中的分布，通过细胞壁对Cd的固定作用减少Cd 向地上部转移。由此可见，Se对Cd 的阻控机制受作物类型和品种差异的影响。

紫色小麦与传统小麦相比，具有对重金属低积累的特性[16]。本课题组在前期大田试验研究中发现，紫色小麦比传统普通小麦有更低的Cd积累能力，但其籽粒中Cd含量仍未达到《食品安全国家标准 食品中污染物限量》（GB 2762—2017）对Cd的要求。因此，本研究拟对紫色小麦叶面喷施亚硒酸钠（Na2SeO3），通过分析不同器官中Cd富集、转运和亚细胞分布特征，探讨施Se 对紫色小麦籽粒Cd 积累的影响，以期为今后利用该技术减少紫色小麦Cd积累提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

大田试验位于四川省成都市金堂县某安全利用耕地。该试验地土壤类型为中性紫色土，其耕层（0～20 cm）pH 为7.42，有机质含量为12.44 g·kg-1，碱解氮、有效磷、速效钾的含量分别为97.23、17.56、95.83 mg·kg-1，Cd 含量为0.35 mg·kg-1。供试的4 份小麦材料分别为蜀紫麦1702、蜀紫麦1705、蜀紫麦1706和紫糯麦168。采用Gao 等[17]的方法进行Na2SeO3溶液的配制：将2 767 mg的Na2SeO3固体溶解于1 L去离子水中，得到16 mmol·L-1的Na2SeO3溶液。使用前将Na2SeO3溶液分别稀释到0.2、0.4、0.8 mmol·L-1（分别记作Se1、Se2、Se3），喷施等量去离子水作为空白对照（CK）。

1.2 试验设计

小麦于2020 年10 月29 日播种，播种方式为撒播，播种量为150 kg·hm-2。4 种小麦均设置CK、Se1、Se2、Se3 4个处理，小区面积2 m×2 m，随机区组设计，每个处理重复3 次，共48 个试验小区，在小区周围设置1 m 的缓冲区。在小麦孕穗期至灌浆期每间隔7 d进行1 次叶面喷施，每个小区每次的喷施量为1.5 L，共喷施3 次（4 月1 日、8 日、15 日）。于第3 次喷施后第14 天（4 月29 日）采集植物鲜样测定根、叶亚细胞中的Cd 含量，小麦成熟后（5 月16 日）采集样品分别测定根、茎、叶、籽粒中的Cd含量。

1.3 样品采集与处理

试验小区所在田块地形起伏小、土壤理化特征均匀。于小麦播种前采用梅花法设置7 个混样点，采集1 份耕层混合土样用于土壤Cd 含量及其他基础理化性质分析。为进行小麦各器官中亚细胞组分Cd含量分析，于第3 次叶面喷施后第14 天（4 月29 日），分别在每个处理小区距离边界0.3 m 的区域内，按五点取样法采集5株生长状况良好的小麦混合成1份小麦鲜样，共采集48 份。鲜样用去离子水洗净后将根、叶分别研磨，根据Jiang 等[18]的方法通过差速离心分离得到亚细胞内细胞壁、细胞器、可溶性组分，之后测定各组分中的Cd 含量。具体操作：样品采集洗净后擦干表面水分，收集到离心管并放入液氮中带回实验室，然后快速转移到-80 ℃冰箱保存；称取新鲜根系、叶片各0.2 g，然后加入组成为250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1Tris-HCl（pH=7.5）与1 mmol·L-1二硫赤鲜糖醇（Dithioerythritol，DTE）的预冷提取液，充分研磨成匀浆液，将匀浆液转移至离心管中在4 000 r·min-1条件下离心15 min，沉淀即为细胞壁组分，再将上清液在10 000 r·min-1条件下离心40 min，沉淀为细胞器组分，上清液为可溶性组分，试验操作均在4 ℃下进行；细胞壁和细胞器组分经10 mL 混酸（VHNO3∶VHClO4=4∶1）消解后，稀释至25 mL，可溶性组分直接稀释至25 mL，采用电感耦合等离子体发射光谱仪（Varian 720ES ICPOES，检出限为1 μg·L-1）测定稀释液中的Cd含量。

为进行成熟期小麦各器官Cd 含量分析，于小麦成熟后（5 月16 日），以相同的方法采集48 份小麦混合样品，用去离子水洗净后分为根、茎、叶和籽粒4个部分，在烘箱中105 ℃杀青30 min后，70 ℃烘干至质量恒定。将小麦各器官的样品经粉碎机粉碎，然后分别称取各样品0.3 g于锥形瓶中，加入10 mL混酸（VHNO3∶VHClO4=4∶1）消解，稀释至25 mL后测定Cd含量。

1.4 数据分析

采用生物富集系数（Bioconcentration Factor，BCF）和转运系数（Translocation Factor，TF）来评价重金属在小麦各部位中的积累转运能力[19]。BCF 为小麦各器官Cd 含量（mg·kg-1）与土壤中Cd 含量（mg·kg-1）的比值；TFA-B为B 器官Cd 含量（mg·kg-1）与A 器官Cd 含量（mg·kg-1）的比值；小麦A 器官Cd 的分配比例为A 器官Cd 含量（mg·kg-1）与根、茎、叶、籽粒Cd 含量总和（mg·kg-1）的比值。

数据采用Excel 2019 进行处理并制作表格。利用SPSS Statistics 20.0 软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），用Duncan 法进行处理间多重比较（P＜0.05），使用Origin 2021制图。根据假设的因果关系，使用Rstudio 2021，应用结构方程模型（SEM）来探究Se 浓度和小麦各器官Cd 含量对籽粒Cd 含量的直接和间接影响，使用PowerPoint 2019制图。

2 结果与分析

2.1 叶面喷施Se对小麦各器官Cd含量的影响

4 种小麦根、茎、叶、籽粒中的Cd 含量随Na2SeO3喷施浓度升高呈下降趋势（图1）。Se3处理时，4种小麦的籽粒Cd 含量下降最明显，降幅为47%～63%，其中紫糯麦168 降幅最大。根、茎、叶中Cd 含量也呈现显著下降趋势，降幅范围分别为25%～39%、27%～42%和18%～33%。

图1 叶面施Se对小麦各器官Cd含量的影响Figure 1 Effects of foliar Se application on Cd content in wheat organs

2.2 喷施Se对小麦Cd富集及转运的影响

在小麦各器官中Cd分布较高的器官为根和叶，占比分别为28%～36%和27%～38%，其次为茎，占比为21%～25%，籽粒对Cd 的积累能力最弱，仅占比10%～16%（图2）。喷施Se 后，籽粒中Cd 分布占比下降1～7个百分点，其中紫糯麦168 下降最多。从作用显著性和降幅来看，喷施Se对紫糯麦168籽粒Cd含量及分布比例的降低效果最好。

图2 叶面施Se对小麦各器官Cd分布比例的影响Figure 2 Effects of foliar Se application on Cd distribution proportion in wheat organs

叶面喷施Se 后，4 种小麦各器官Cd 富集系数均显著降低（P＜0.05），且随着Na2SeO3浓度升高降幅增大（表1）。其中籽粒富集系数的减小程度最大，Se3处理时，4种小麦籽粒Cd富集系数降低45%～75%。

小麦Cd转运系数表现为TF（茎-叶）＞TF（根-茎）＞TF（茎-籽粒）＞TF（叶-籽粒）（表2）。叶面喷施Se 后，TF（茎-籽粒）和TF（叶-籽粒）显著减小（P＜0.05），且随Na2SeO3浓度升高，下降程度逐渐增大，Se3处理时，降幅分别为22%～46%和34%～61%，其中紫糯麦168 降幅最大。TF（茎-叶）和TF（根-茎）整体变化不显著。

表2 叶面施Se对小麦Cd转运系数的影响Table 2 Effects of foliar Se application on Cd translocation factor in wheat

2.3 叶面喷施Se对小麦根和叶亚细胞中Cd分布的影响

2.3.1 根亚细胞Cd分布

4 种紫色小麦根亚细胞Cd 含量顺序为可溶性组分＞细胞壁＞细胞器，根亚细胞各组分中Cd 含量随Na2SeO3喷施浓度的升高呈下降趋势（表3）。其中，Se3 处理与CK 相比，4 种小麦的Cd 含量在细胞壁中降低47%～67%，在细胞器中降低57%～72%，在可溶性组分中降低26%～52%。就Cd 的分配比例来看，小麦根部的Cd 主要积累于可溶性组分中，占小麦根部Cd 总量的53%～73%，其次于细胞壁中，占比为18%～33%（图3）。Se1、Se2 处理后，4 种小麦根亚细胞各组分Cd 分布占比变化较小，随着Na2SeO3浓度的进一步提升（Se3 处理），细胞壁的Cd 分布占比较CK 下降了3～12 个百分点，细胞器的Cd 分布占比下降了4～7 个百分点，而可溶性组分的Cd 分布占比上升了8～16 个百分点。

图3 叶面施Se对小麦根亚细胞中Cd分布比例的影响Figure 3 Effects of foliar Se application on proportion of subcellular distribution of Cd in the roots of wheat

表3 叶面施Se对小麦根亚细胞中Cd含量（以鲜质量计）的影响Table 3 Effects of foliar Se application on subcellular distribution of Cd conten（tcalculated by fresh weight）in the roots of wheat单位：mg·kg-1

2.3.2 叶亚细胞Cd分布

由表4 可知，小麦叶部Cd 含量顺序为可溶性组分＞细胞壁＞细胞器。叶亚细胞各组分中Cd 含量随Na2SeO3喷施浓度的升高呈下降趋势，与根亚细胞Cd含量变化情况相似。其中，Se3 处理与CK 相比，4 种小麦细胞壁中Cd 含量降低50%～53%，细胞器中降低75%～78%，可溶性组分中降低39%～46%。小麦叶片中的Cd 主要积累于可溶性组分中（图4），占叶片Cd总量的59%～71%，其次为细胞壁，占比为21%～25%。随着Na2SeO3喷施浓度的升高，蜀紫麦1702、蜀紫麦1705 和蜀紫麦1706 小麦叶亚细胞可溶性组分中的Cd 分布占比上升了6～10 个百分点，细胞器中下降了5～10 个百分点，而细胞壁中分布占比变化不明显；紫糯麦168 在Na2SeO3喷施浓度最高时才出现明显变化，可溶性组分中Cd 分布占比上升6 个百分点，细胞器中下降5个百分点，细胞壁中下降1个百分点。

表4 叶面施Se对小麦叶亚细胞中Cd含量（以鲜质量计）的影响Table 4 Effects of foliar Se application on subcellular distribution of Cd concentration（calculated by fresh weight）in the leaves of wheat单位：mg·kg-1

3 讨论

不同品种小麦对Cd的积累存在一定差异。肖昕等[20]对苏徐2 号小麦的研究发现，成熟期小麦植株中不同器官Cd 含量顺序为根＞叶片＞茎＞颖壳＞果实。本试验在3.5 mg·kg-1Cd胁迫环境下，蜀紫麦1702、蜀紫麦1705和蜀紫麦1706根部Cd富集最多，其次是叶部，而紫糯麦168 叶部Cd 含量大于根部（图1），这与任超等[21]在土壤Cd 为4 mg·kg-1水平下对小麦的研究结果相似。这可能是由于不同小麦品种存在基因型差异，从而导致品种间Cd 积累特征的不同[22]。Wu等[23]发现，经Na2SeO3溶液喷施后，小麦各个器官的Cd含量均显著降低。Xia等[24]的盆栽和田间试验结果同样表明，叶面施Se 可显著降低小麦灌浆期籽粒中Cd的含量。屈婵娟等[25]的研究发现，施Se 可降低油菜根、茎、叶中Cd的含量。本研究结果与以上研究大致相同，Na2SeO3浓度在0.2～0.8 mmol·L-1时，小麦各器官Cd 的含量随Na2SeO3浓度增加呈降低趋势，其中籽粒Cd含量下降最高，达63%（图1）。在对水稻的研究中发现，Se和Cd存在明显的拮抗作用，二者可形成难溶性复合物，从而减少植物根部对Cd 的吸收[26]。卞威乐斯等[27]的研究发现，施Se 不仅可以降低植物对Cd 的吸收，还可以降低已吸收的Cd 的活性。此外，外源Se 可抑制Cd 胁迫下植物根部Cd 吸收基因的表达，从而减少对Cd 的吸收[28]。本研究中，喷施Se 后，各器官Cd 富集系数相应降低，表明Cd 在各器官中的积累能力受到抑制。籽粒Cd 含量与根（图5a）、茎（图5b）、叶（图5c）Cd 含量存在正相关关系（P＜0.05），叶面喷施Se 减少了小麦根部对Cd 的吸收，从而减少了Cd 向地上部转运，因此籽粒中Cd 的积累量相应降低。

图5 籽粒与其他各器官Cd含量的相关性分析Figure 5 Relationships of Cd content between grain and other organs

本研究探讨了4 种小麦不同器官间Cd 的转运特征，经Na2SeO3溶液喷施后，4 种小麦的TF（茎-籽粒）和TF（叶-籽粒）均显著下降（P＜0.05），然而，蜀紫麦1702 在Se1 处理后TF（根-茎）比其他3 种小麦显著降低（表2），这是该品种籽粒Cd含量大幅下降的原因。表明喷施Se 后各品种小麦转运特征存在差异，从而导致各品种小麦籽粒中Cd含量降低程度不同。进一步分析发现，4 种小麦经Se 处理后TF（茎-籽粒）和TF（叶-籽粒）下降分别达到22%～46%和34%～61%（表2），小麦籽粒Cd 含量与TF（茎-籽粒）（图6c）和TF（叶-籽粒）（图6d）存在显著的正相关关系，表明叶面施Se 主要是通过抑制Cd 从茎到籽粒和叶到籽粒的运输来降低籽粒Cd 的积累量。Jiang 等[29]在对水稻的研究中发现，叶面施Se 可减少Cd 由茎、叶向穗部的转运，使糙米中Cd 含量降低了40.36%。叶面可通过气孔和表皮亲水小孔直接吸收养分[30]，叶面喷施可使更多的Se 元素进入小麦茎、叶组织。Na2SeO3与茎、叶组织中的Cd 相结合形成难溶的CdSeO3，改变细胞膜对Cd的通透性[31]，从而抑制Cd由茎、叶向籽粒转运。

图6 籽粒Cd含量与小麦Cd转运系数的相关性分析Figure 6 Relationships between grain Cd content and Cd transport coefficient in wheat

基于Se 浓度和小麦各器官中Cd 含量之间的影响关系生成的结构方程模型图（图7），进一步表明了叶面施Se 通过茎、叶对籽粒Cd 含量产生影响的路径。该模型解释了小麦籽粒Cd 含量方差的12%。Se对小麦根、叶Cd 含量有显著的、直接的负效应（P＜0.001），其中，对叶的影响强度最大，为-0.97；茎、叶Cd 含量对籽粒Cd 含量有显著的、直接的正效应（P＜0.001），影响强度分别为0.40 和0.38。Gao 等[17]在对水稻的研究中也发现茎、叶中Cd 含量对籽粒Cd 含量有显著影响。上述结果表明，叶面施Se 可通过影响小麦叶Cd 含量来影响籽粒Cd 含量，也可通过抑制根对Cd 的吸收，进而改变茎、叶Cd 含量，最终影响籽粒对Cd的积累。

图7 叶面施Se对小麦Cd含量的影响路径结构方程模型图Figure 7 Structural equation model for the path of effects of foliar Se application on Cd content in wheat

Cd在亚细胞水平的分布特征能深入揭示Se对植物吸收和转运Cd 的影响机制[32]。本研究发现Cd 在小麦根、叶亚细胞中均主要分布于可溶性组分，其次是细胞壁，细胞器内含量最低，叶面喷施Se 后，增加了Cd 在可溶性组分中的比例。然而，李虹颖等[33]的研究表明，早籼788 水稻根、茎、叶亚细胞中细胞壁组分Cd 含量最高，且随施Se 浓度升高呈上升趋势。由此可见，不同植物中Cd 的亚细胞分布模式以及Se 对其分布的影响存在明显差异。相关研究表明，植物会对进入细胞内的Cd通过区室化积累于液泡或固定在细胞壁，或形成Cd 盐沉淀以及通过螯合方式来减轻Cd胁迫对植物的伤害[34]。大部分Cd会与细胞中的植物螯合肽（PCs）形成稳定的PC-Cd 螯合物，该螯合物转运至液泡中，以减少Cd 在细胞间的流动。Se 能促进谷胱甘肽（GSH）系统对PCs 的合成以及相关酶的活性[35]，PCs的增多又直接影响到液泡对Cd的分隔容量（VSC）大小[36]，进而增强Cd 在液泡中的滞留作用[37]。本试验中，喷施Se 后小麦根、叶亚细胞中的Cd更倾向积累于可溶性组分中。这与张雯等[14]对水稻的研究结果相似。说明本研究中Na2SeO3的施用促进了紫色小麦根、叶细胞中的Cd被区室化于液泡。Lux等[38]的研究发现，Cd 主要通过质外体在小麦根、茎、叶、籽粒间运输。随着Na2SeO3的浓度增大，Cd 在可溶性组分中的比例相应增大，大量Cd 被阻隔于液泡中，减少了其在质外体中的流动转移，最终减少了Cd向地上部的转运，尤其是减少了由茎向籽粒和叶向籽粒的转运。这说明Cd 的区室化是减少Cd 向籽粒转运的一个重要因素。

4 结论

叶面喷施Na2SeO3能显著降低紫色小麦各器官Cd的含量和富集系数，同时提高Cd在小麦根系中的分布占比，降低在籽粒中的分布占比。紫色小麦根、叶亚细胞中Cd的分布特征相似，含量顺序为可溶性组分＞细胞壁＞细胞器。叶面喷施Se能降低小麦亚细胞各组分的Cd 含量，并促进细胞中Cd 区室化分布于可溶性组分，有效阻控Cd从茎到籽粒和叶到籽粒的转运，这是Se减少籽粒Cd积累量的主要原因之一。