不同水稻品种光合特性及叶绿素对臭氧浓度升高的响应差异

何龙鑫，徐彦森，冯兆忠，张涵，曹蓉，钟鑫，马艳泽

（南京信息工程大学应用气象学院，中国气象局生态系统碳源汇重点开放实验室，江苏省农业气象重点实验室，南京 210044）

近地层臭氧（O3）是由氮氧化物（NOx）、挥发性有机化合物（VOCs）等O3前体物经过光化学反应形成的[1]，对植被具有毒害作用[2-4]。随着工业化、城市化进程的不断加快以及人类活动的日益加剧，过去几十年里北半球中纬度地区的O3浓度以每年0.5%～2%的速度持续增长[5-6]，且一些地区O3浓度的平均小时最高值可达109 nmol·mol-1，远超O3对植物的危害阀值浓度（40 nmol·mol-1）[7-8]。近几年我国O3浓度急速上升，O3污染对我国粮食作物的生长产生了巨大影响[9]，造成了严重的经济损失[10]。据研究统计，当前O3污染导致我国水稻、小麦和玉米的相对产量损失分别达到23%、33%和9%[11]，仅2014—2017 年，O3污染就导致长江三角洲地区水稻年平均减产2.445×109t，约占实际产量的9.1%，造成年平均经济损失达10.37 亿美元[12]。

O3通过叶片气孔进入质外体后，形成活性氧自由基（ROS）并引发氧化胁迫。当作物长时间暴露在高浓度O3下，ROS 的累积量一旦超过植物自身的解毒防御阈值，便会导致细胞程序性死亡，从而加速叶片衰老、降低叶绿素含量、抑制叶片光合作用，进而造成产量下降[13-14]。因此，探究不同水稻品种O3敏感性的差异，选育O3耐受性品种将有利于应对O3污染对水稻产量的危害[15]。目前研究人员已经开展了大量O3熏蒸对水稻光合作用[16]、生理生化[17]、地上生物量、产量[18]以及限制因素[19-20]等方面的影响研究。O3浓度升高降低作物产量主要是由于O3通过气孔进入作物体内破坏了光合作用机制，从而减少同化物的积累，并改变同化物的分配[21]。利用光合速率变化可以有效并快速评估不同水稻品种O3敏感性并揭示其机理。如Pang 等[22]在整个水稻生育期进行1.5 倍大气O3浓度熏蒸试验，通过光合速率和产量指标揭示了汕优63 的O3敏感性强于武育粳3 号。因此，研究O3对不同水稻品种光合作用的影响差异是揭示水稻品种O3敏感性的重要手段。

Shi 等[23]基于自由式O3浓度增加系统（O3-FACE）研究了O3浓度升高对4个我国水稻品种产量的影响，结果表明杂交稻品种比常规稻品种产量损失更大，这可能与O3浓度升高抑制了杂交稻品种每穗颖花数的形成有关[24]。研究显示，O3浓度升高会对汕优63 的品质产生不利影响[25-26]。目前已经开展了一些水稻的O3-FACE 试验，但其中大部分试验品种单一，只测试了汕优63、武育粳3号等个别品种。关于O3浓度升高下多个杂交稻和常规稻品种的响应差异鲜有研究，对杂交稻和常规稻的O3敏感性差异了解还不够。探究O3熏蒸对多个不同水稻品种的影响差异不仅可为选育O3耐受性品种提供参考，而且有利于更精准地采取减缓O3浓度升高对水稻伤害的防护措施，从而降低O3污染对水稻产量的不利影响。因此，本试验利用O3-FACE 平台，设置两个O3处理，在水稻生长的全生育期对4 个杂交稻品种和8 个常规稻品种进行O3熏蒸试验，探究不同水稻品种间以及杂交稻和常规稻间对O3浓度升高的叶片光合特性指标及叶绿素的响应差异，为选育O3抗性的水稻品种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验地点位于江苏省扬州市江都区（32°25′ N，119°43′ E），地处长江三角洲，属于亚热带湿润气候。当地长期实行稻麦轮作体系，是典型的农田生态系统，2009—2018 年平均气温和年平均降水量分别为16.2 ℃和1 131.3 mm，年日照时间为1 936.1 h，年无霜期＞290 d。

1.2 试验设计

本试验在O3-FACE 平台中进行，平台中设有O3升高（E-O3）圈和环境大气（A-O3）圈各4 个。每个圈均为直径14 m的正八面形，通过围成正八角形的8根PPR管上的许多小孔向圈中心喷射O3气体，PPR管位于作物冠层上方20 cm 左右，计算机系统通过圈中心传感器对大气中O3浓度进行实时监测，自动调节混合气体中的O3浓度，从而控制E-O3圈内O3浓度保持为A-O3圈内O3浓度的1.5 倍。O3熏蒸从2021 年7 月13日开始，10月28日停止，共计108 d，每日熏气时间为8：00—18：00，雨天关闭设备停止通气，暂停熏蒸天数为23 d，有效熏蒸天数为85 d。整个熏蒸期间内，A-O3圈的O3浓度日均值为36.4 nmol·mol-1，E-O3圈的O3浓度日均值为52.9 nmol·mol-1。A-O3圈只对冠层空气O3浓度进行监测，其余环境条件均与自然环境条件一致。

本试验分别在A-O3圈和E-O3圈内设置长宽各3 m 的试验样地。每个试验样地内分别种植12 个水稻品种，包括4 个杂交稻品种（甬优2640、扬两优6 号、汕优63、丰优香占）和8 个常规稻品种（淮稻5 号、金香玉1号、南京16、南粳5055、南粳9108、武育粳3号、武运粳24、扬稻6号）。2021年6月27日人工插秧，自西向东依次种植杂交稻和常规稻，为保证试验随机性，杂交稻内和常规稻内分别随机种植，南北向为同一品种，每个水稻品种种植13穴，每穴间隔为25 cm，每两个供试水稻品种间隔25 cm，杂交稻与常规稻的相邻分界间隔30 cm。试验样地采用大田常规田间管理方式。图1为O3熏蒸期间A-O3处理与E-O3处理的白天10 h平均O3浓度变化。

1.3 指标测定

1.3.1 光合特性指标的测定

采用Li-6800便携式光合测定仪（LI-COR，美国）分别于9 月21 日（灌浆前期）和10 月2 日（灌浆中期）测定叶片光合特性指标。具体测定方法为：晴天的9：00—11：30，在每个试验样地内选取每个品种光照条件好、长势较一致的旗叶叶片进行光合特性指标测定，测定时光合有效辐射设置为1 500 μmol·m-2·s-1，CO2浓度设置为410 μmol·mol-1。光合特性指标包括：饱和光合速率（Asat）、气孔导度（gs）、叶片胞间CO2浓度（Ci）、瞬时水分利用效率（WUE）以及表观光合电子传递效率（ETR），其中WUE通过Asat与gs的比求得。

1.3.2 叶绿素总量的测定

分别于9 月21 日和10 月2 日选取完成光合特性指标测定的叶片，用打孔器取直径为0.7 cm的圆形叶片，将其放入2 mL 95%的乙醇中浸泡，并放入4 ℃冰箱中黑暗保存直至完全褪色。将提取液分别于664、649 nm 与470 nm 处测定吸光度，并根据Lichtenthaler[26]的方法得到叶绿素总量（Total chl）。

1.4 数据统计分析

采用Excel 2016 对试验数据进行初步整理，利用JMP 11.0检验数据的正态性与方差齐性，统计分析采用裂区试验设计，以O3处理为主区，品种为裂区，运用JMP 11.0 中的裂区设计方差模型对各变量进行方差分析，采用t双尾检验分析单一品种不同O3处理下各变量的显著性差异。采用Origin 2022制图，柱形图中的数据为平均值±标准误差（SE）。

2 结果与分析

2.1 O3浓度升高对不同水稻品种的影响

灌浆前期，O3浓度升高显著降低了供试水稻的Asat和gs（P＜0.01），不同品种的Asat和gs的差异也均达到显著水平（P＜0.05）。灌浆中期，O3浓度升高显著降低了供试水稻的Asat（P＜0.05），且不同品种的Asat的差异也达到显著水平（P＜0.05），而gs变化不显著。在任一生育期，O3与品种间的交互作用均未对Asat和gs产生显著影响（图2）。

由图2（a）和图2（b）可见，O3浓度升高下，灌浆前期丰优香占、灌浆中期扬两优6号和扬稻6号的Asat分别显著下降16.7%、40.4%和22.0%。由图2（c）和图2（d）可见，O3浓度升高下，灌浆前期南粳9108、武运粳24 和灌浆中期扬两优6 号的gs分别显著下降31.6%、35.1%和47.5%，其余品种的Asat和gs变化均不显著。

图2 O3浓度升高对不同水稻品种叶片饱和光合速率（Asat）和气孔导度（gs）的影响Figure 2 Effects of elevated O3 concentration on light-saturated photosynthetic rate（Asat）and stomatal conductance（gs）in leaves of different rice cultivars

如图3所示，两个时期O3浓度升高对供试水稻的Ci和WUE 值均无显著影响，不同品种的Ci和WUE 值的差异均达到显著水平。O3和品种间的交互作用对Ci和WUE的影响在灌浆前期达到显著水平（P＜0.01）。

由图3（a）和图3（b）可见，O3浓度升高下，灌浆前期武运粳24的Ci值显著下降，淮稻5号在两个时期的Ci值均显著变化。由图3（c）和图3（d）可见，O3浓度升高下，武运粳24 在灌浆前期的WUE 值显著上升38.9%，淮稻5 号在灌浆前期和灌浆中期的WUE 值分别显著上升28.1%和显著下降26.5%，其余品种的Ci和WUE值变化均不显著。

图3 O3浓度升高对不同水稻品种叶片胞间CO2浓度（Ci）和瞬时水分利用效率（WUE）的影响Figure 3 Effects of elevated O3 concentration on intercellular CO2 concentration（Ci）and instantaneous water use efficiency（WUE）in leaves of different rice cultivars

如图4所示，两个时期O3浓度升高对供试水稻的ETR 值和Total chl 值均无显著影响，而不同品种Total chl 值的差异在两个时期均达到显著水平（P＜0.01），不同品种的ETR 值差异在灌浆中期达到显著水平（P＜0.05）。在任一生育期，O3与品种间的交互作用均未达到显著水平。灌浆前期O3浓度升高下甬优2640和丰优香占的ETR 值分别显著下降34.2%和32.0%，其余品种的ETR值和Total chl值变化均不显著。

图4 O3浓度升高对不同水稻品种叶片表观光合电子传递效率（ETR）和叶绿素总量（Total chl）的影响Figure 4 Effects of elevated O3 concentration on apparent photosynthetic electron transfer efficiency（ETR）and total chlorophyll（Total chl）in leaves of different rice cultivars

2.2 O3浓度升高对杂交稻和常规稻的影响

由表1 可知，杂交稻在O3浓度升高下，Asat和ETR值在灌浆前期分别平均显著下降15.1%和24.5%，在灌浆中期均无显著变化；gs在灌浆前期变化不显著，在灌浆中期平均显著下降27.4%；WUE由灌浆前期的小幅度下降变为灌浆中期的小幅度上升。在O3浓度升高下，常规稻的Asat在两个时期变化均不显著，gs在灌浆前期平均显著下降20.2%，但在灌浆中期变化不显著；ETR 由灌浆前期的几乎不变到灌浆中期的下降；WUE 由灌浆前期的上升变为灌浆中期的小幅度下降。杂交稻和常规稻的Ci在两个时期几乎维持不变，Total chl在灌浆中期下降。

3 讨论

光合作用是作物积累有机物的主要过程，可维持作物的生长。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，是影响光合作用的重要因子。随着水稻进入灌浆期，植株内部碳、氮代谢发生变化，光合机构不断损伤，上部叶片的光合功能迅速衰退，叶片逐渐衰老，叶绿素含量逐渐降低，O3浓度升高会加速这一进程。本研究发现，灌浆中期水稻的Asat、gs和Total chl 值普遍低于灌浆前期，这主要与O3浓度升高对水稻生长的影响具有累积效应有关。不同水稻品种的光合特性对O3胁迫的响应差异显著，且杂交稻的Asat、gs和ETR值的响应比常规稻更明显，表明杂交稻比常规稻对O3胁迫更敏感。O3具有强氧化性，高浓度O3通过叶片气孔进入植物体内会损害叶片表观特征，导致叶片的光合速率降低[27-29]。进入质外体的O3通量受气孔交换速率的调控，而气孔数量、大小以及开度等又决定了O3进入质外体空间的速率[30]，由此可见，气孔因素对于调控植物对O3的吸收有重要作用。Ainsworth等[31]对在O3-FACE 中进行的水稻试验进行整合分析发现，相较于过滤空气环境，水稻在O3浓度为59 nmol·mol-1的环境中生长时，其叶片Asat平均下降28%，在O3浓度为55 nmol·mol-1的环境中生长时，其叶片gs平均下降23%。本试验中，灌浆前期和灌浆中期分别有丰优香占、扬两优6号和扬稻6号的Asat显著下降，其他品种的Asat变化不显著，这表明不同水稻品种的Asat对O3胁迫的响应存在差异，且丰优香占、扬两优6 号和扬稻6 号对O3较敏感。研究普遍发现O3浓度升高会导致植物gs下降，gs降低一方面限制CO2的进入、降低光合作用，另一方面也是植物应对O3浓度升高的一种保护性机制[32]，即植物通过降低gs来减少进入体内的O3通量，从而抵抗O3浓度的升高[33]。本试验中，两个时期均有不同品种的gs显著下降，表明O3浓度升高对不同水稻品种的gs的影响存在差异。

O3浓度升高可以通过气孔因素和非气孔因素共同影响Asat，Ci是水稻光合作用的直接限制因子，其变化方向是判断光合速率变化主要受气孔因素还是非气孔因素影响的重要依据。Feng 等[19]利用O3-FACE探究O3浓度升高对5 个冬小麦品种光合作用影响的差异时发现，O3对不同冬小麦品种光合作用影响的差异主要取决于非气孔因素（如抗氧化酶）而不是gs。本试验中，在两个时期不同水稻品种的Asat和gs下降的同时，大部分品种的Ci几乎维持不变且ETR发生不同程度的变化，这说明O3浓度升高对不同水稻品种影响的差异主要由于ETR、叶肉细胞同化能力等非气孔因素的限制。灌浆前期杂交稻的Asat和ETR值显著下降，常规稻的Asat小幅度下降且ETR值维持不变，这表明O3浓度升高对杂交稻和常规稻的光合作用影响存在差异，且对杂交稻影响更大，其差异可能与ETR的限制有关。

WUE 是解释植物固碳耗水权衡关系的重要指标，提高WUE 有利于提高植物单位耗水能力下的碳固定量。现有研究利用O3-FACE 分别探究了O3浓度升高对几个水稻品种的WUE、光合生化能力和Ballberry 模型参数的影响。Masutomi 等[34]通过光合模型模拟发现，高浓度O3主要是通过影响汕优63 的叶片光合和气孔回归关系中的截距来降低叶片的WUE。在本研究中，O3浓度升高下常规稻的WUE 由灌浆前期的上升变为中期的小幅度下降，造成这种变化的原因主要是O3浓度升高导致灌浆中期大部分常规稻品种叶片光合作用降低大于gs的降低，光合与气孔呈现解耦合关系[35]，进而导致WUE 降低。研究发现O3浓度升高会降低叶片叶绿素含量[36]，促进膜脂过氧化作用，损害水稻膜系统，促使叶片叶绿素降解导致的叶绿素含量迅速下降并加剧叶片衰老。本试验中，O3浓度升高下不同水稻品种Total chl 主要在灌浆中期下降，且杂交稻和常规稻的响应相似，这主要与叶绿素含量对O3浓度升高的响应具有累积效应有关[19]。

水稻光合速率变化是有效且快速评估不同水稻品种O3敏感性的重要依据。考虑到不同品种生育期对O3响应的差异，本试验利用O3浓度升高下水稻品种两个时期Asat下降均值并结合变化显著性进行不同品种O3敏感性的筛选。本研究中仅扬两优6 号在两个时期的Asat下降均值大于25%，且其Asat在灌浆中期显著下降，表明扬两优6 号对O3敏感性最强；淮稻5号和南粳5055 在两个时期的Asat下降均值小于10%，且其Asat在两个时期变化均不显著，表明供试品种中淮稻5 号和南粳5055 对O3抗性强。现有研究表明相比于常规稻，O3浓度升高下杂交稻的响应变化更明显[22-23]。本研究中，O3浓度升高下杂交稻比常规稻的光合特性指标响应更显著，且更多的常规稻品种的O3抗性更强，如淮稻5号、南粳5055等，这表明杂交稻比常规稻对O3胁迫更敏感。总之，本研究结果表明，O3浓度升高对不同水稻品种光合作用的影响存在差异，对叶绿素影响差异不显著，杂交稻的O3敏感性强于常规稻。未来可结合水稻品种抗氧化特性、产量构成等指标验证本试验结论并进一步深入研究，为研究不同水稻品种对高浓度O3胁迫的响应机制提供可靠依据，为O3耐受性品种选育以及减缓O3污染对水稻的影响提供科学指导。

4 结论

O3浓度升高下不同水稻品种间光合作用响应存在品种差异，叶绿素含量变化差异不显著，杂交稻比常规稻对O3胁迫的敏感性更强。O3浓度升高对不同水稻品种光合作用影响的差异主要由于电子传递速率等非气孔因素的限制。基于水稻饱和光合速率变化值，本试验选用的品种中扬两优6 号对O3最敏感，淮稻5号和南粳5055对O3抗性强，这2个抗性品种在O3污染下可广泛种植。