基于基因组序列分析的烟草轻绿花叶病毒江苏辣椒分离物侵染性克隆构建

高晓晓，涂丽琴，杨柳，刘亚楠，高丹娜，孙枫，李硕，章松柏，季英华

基于基因组序列分析的烟草轻绿花叶病毒江苏辣椒分离物侵染性克隆构建

1江苏省农业科学院植物保护研究所，南京 210014；2长江大学农学院/农林病虫害预警与调控湖北省工程技术研究中心，湖北荆州 434025

【目的】烟草花叶病毒属（）是危害辣椒、烟草等茄科作物的主要病毒之一，严重影响蔬菜作物的种植和生产。本研究旨在探明侵染江苏省南京市辣椒的烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus，TMGMV）分离物（TMGMV-JS）的基因组结构特征、系统进化关系及其致病性，为TMGMV的防控提供科学依据。【方法】从江苏省南京市采集的辣椒病样，提取总RNA，利用TMGMV特异检测引物确认阳性后，设计病毒特异性全长引物扩增TMGMV-JS全基因序列，通过同源重组的方法克隆至pCB301植物表达载体上，获得TMGMV-JS分离物基因组序列和全长cDNA侵染性克隆。BLAST分析TMGMV-JS分离物与已报道分离物的同源性，利用MEGA7软件的邻接法进行系统进化分析。将侵染性克隆通过农杆菌浸润本氏烟和辣椒，经RT-PCR和Western blot检测验证侵染效果，测定TMGMV-JS分离物的致病性。【结果】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV全长序列为6 356 nt，编码4个功能蛋白，分别为126K复制相关蛋白、183K复制酶、运动蛋白MP和外壳蛋白CP。同源性分析结果显示TMGMV-JS与重庆分离物TMGMV-TN29（MF139550）同源性最高，厦门分离物（JX534224）次之，系统进化分析结果也显示TMGMV-JS与其他TMGMV聚于同一大分支，其中与重庆、厦门两个分离物在同一小分支，相对近缘。构建的pCB301-TMGMV-JS侵染性克隆载体可以系统侵染本氏烟，引起叶片黄化，植株系统性坏死；也可以系统侵染辣椒，引起叶片斑驳、卷曲和植株矮化等症状。【结论】侵染江苏省南京市辣椒的TMGMV-JS分离物基因组全长6 356 nt，与国内重庆、厦门TMGMV分离物具有较近的亲缘关系，同属于一个分支；构建的TMGMV-JS侵染性克隆可以系统侵染本氏烟和辣椒，在本氏烟上会导致系统性坏死。

烟草轻绿花叶病毒；分子特征；侵染性克隆；致病性分析

0 引言

【研究意义】烟草轻绿花叶病毒（tobacco mild green mosaic virus，TMGMV）为烟草花叶病毒属（）成员，主要危害烟草和辣椒（）等茄科作物[1]，还能侵染如夹竹桃科的狗牙花[2]、凤仙花科的凤仙花[3]、苦苣苔科[4]、鸭跖草科的小蚌兰[5]等多种植物。TMGMV可通过机械摩擦传毒，感染TMGMV后引起叶片褪绿、花叶、扭曲变形，且影响辣椒等茄科作物果实形状和大小，降低其商品价值。辣椒是茄科辣椒属一年或有限多年生草本植物，为重要的经济作物和蔬菜作物，在生产过程中遭受多种病害侵扰，其中已报道约60多种病毒侵染辣椒[6]。江苏省辣椒常年种植面积约8.00×104hm2以上[7]，近年来病毒病的发生随着种植面积的扩大而加重。因此，分析侵染江苏南京辣椒TMGMV的基因组特征和致病性，对该病毒病的防控具有重要意义。【前人研究进展】TMGMV是一种单链RNA病毒，基因组全长约6.4 kb，病毒包含4个开放阅读框，分别编码126K复制相关蛋白（126K replication-associated protein）和183K复制酶（183 kDa RNA-dependent RNA polymerase）、运动蛋白（movement protein，MP）和外壳蛋白（coat protein，CP）[8]。该病毒最早在烟草上发现，被认为是烟草花叶病毒（TMV-U2）的一种温和形式[9]，后被命名为烟草轻绿花叶病毒[10]。目前在韩国[11]、委内瑞拉[12]、突尼斯[13]、巴拿马[14]、密西西比[15]、美国[3]、土耳其[16]等多个国家和地区均有报道TMGMV的危害。国内最早在2005年台湾地区的辣椒上检测到TMGMV[17]，2013年在福建厦门辣椒上报道了该病毒[18]，之后在山东[19]、湖南[20]、重庆[21]和贵州[22]等地区出现危害。【本研究切入点】国内虽有多个省份报道TMGMV的危害，但TMGMV致病特征相关报道还很少，虽然国外有TMGMV致病相关报道，但其与国内分离物还存在一定差异，目前国内尚未见通过构建侵染性克隆研究TMGMV致病的相关报道。【拟解决的关键问题】以烟草轻绿花叶病毒江苏辣椒分离物为对象，通过克隆其全基因组，明确其分子结构特征及分类地位，在此基础上通过构建侵染性克隆解析该分离物的致病性，为辣椒上烟草轻绿花叶病毒病防控提供科学依据。

1 材料与方法

试验于2021年1月至2022年9月在江苏省农业科学院植物保护研究所完成。

1.1 样本来源

供试样品来自实验室保存的感染TMGMV的辣椒病样，样品采自江苏省南京市，采集后液氮冷冻置于-80℃冰箱保存备用。

1.2 RNA提取

参考吴淑华等[7]的方法，利用Trizol法提取RNA，Trizol试剂购自宝生物工程（大连）有限公司（Takara），提取的RNA样品置于-80℃冰箱保存。

1.3 RT-PCR反应

以病样总RNA为模板，利用Prime ScriptTM1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Takara）进行反转录，反应体系：oligo dT Primer 1 µL，Randon 6 mers 1 µL，dNTP Mix 1 µL，ddH2O 5 µL，RNA 2 µL，于65℃ 5 min后，再加入5×Prime Script buffer 4 µL，RNase Inhibit 0.5 µL，Prime Script RNase 0.5 µL，ddH2O 5 µL，经30℃ 10 min，42℃ 1 h，70℃ 15 min，4℃结束，cDNA产物置于-20℃冰箱保存。根据TMGMV特异性检测引物524-F和524-R（表1）进行PCR检测验证，PCR扩增总体系为20 µL：2×RapidMaster Mix（Takara）10 µL，上下游引物各1 µL，cDNA 1 µL，ddH2O补足。经95℃ 3 min；95℃ 15 s，47℃ 15 s，72℃ 20 s，35个循环；72℃ 5 min；12℃结束。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 本研究所用引物

1.4 TMGMV-JS全长序列克隆

根据已报道的TMGMV全长序列，设计病毒全长特异性引物TMGMV-ssF和TMGMV-ssR（表1），以cDNA产物为模板，PCR扩增总体系为50 µL：PrimeSTARTMMAX 25 µL，F和R端引物各2 µL，ddH2O 19 µL，cDNA 2 µL。经94℃ 1 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，72℃ 4 min，32个循环；72℃ 7 min，4℃结束后，于1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带大小。

1.5 TMGMV-JS侵染性克隆载体构建

利用Axygen割胶回收试剂盒回收PCR产物，回收产物通过同源重组技术连接到与经I和I双酶切处理的植物表达载体pCB301上，利用载体通用引物pB-F和pB-R（表1）进行PCR检测和酶切验证后，将pCB301-TMGMV-JS重组质粒送至安徽通用生物公司进行序列测定。

1.6 序列分析

根据测序结果，利用DNAstar、Snap gene、Clustal W等软件与NCBI上已公布的TMGMV全基因序列进行基因组结构特征及多重序列比对分析，并利用Blast网站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行同源性分析。利用MEGA7软件的邻接法（neighbor-joining algorithm）进行聚类分析以及系统进化树的构建，进化树的可信度使用1 000次自导复制验证。

1.7 侵染性克隆在本氏烟和辣椒上的致病性分析

将pCB301-TMGMV-JS载体通过冻融法转化GV3101农杆菌感受态细胞（擎科生物），同时转化pCB301空载体作为对照，涂布于含有（50 mg·L-1）和（25 mg·L-1）抗生素的LB固体培养基，28℃倒置培养2—3 d。经PCR检测后挑取单菌落培养至同样抗性的LB液体培养基中，于28℃，220 r/min摇床过夜培养。当过夜培养物吸光度OD600 nm达到0.8—1.2时，6 000×室温离心8 min富集菌体，配置浸润液（10 mmol·L-1MgCl2、10 mmol·L-1MES、100 µmol·L-1AS）重悬菌体，当悬浮液OD600 nm达到0.6时，28℃静置培养2 h。选取3—4周龄本氏烟（），针头轻戳中上部叶片背面，用1 ml注射器取悬浮液浸润叶背，同时接种空载体pCB301作为对照。28℃，220 r/min过夜培养农杆菌菌液OD600 nm达0.8时，注射3—4周龄辣椒（豫樱二号）茎秆。自接种日起记录本氏烟和辣椒发病时间、症状以及发病率，生物试验重复3次，每组3个重复。

采集200 mg发病样品和对照组样品，利用Trizol法提取植物总RNA，利用特异性检测引物524-F和524-R进行RT-PCR检测。取200 mg发病样品和对照组样品加入2倍体积RIPA裂解液（碧云天）提取总蛋白，于4℃ 12 000 r/min离心15 min，取上清加入适量5×SDS loading buffer混匀，99℃加热10 min后12 000 r/min离心1min获得蛋白样品，取10 µL上清进行Western blot检测。Western blot一抗为烟草花叶病毒属通用抗体（实验室保存），羊抗兔二抗购自碧云天。

2 结果

2.1 TMGMV-JS基因组全长序列克隆以及序列分析

选取TMGMV特异性检测引物（524-F和524-R）RT-PCR检测结果阳性的样品作为模板，利用TMGMV-ssF和TMGMV-ssR特异性引物扩增病毒全长序列，通过同源重组的方法连接至pCB301载体后送至生物公司测序，获得TMGMV-JS全基因序列，上传至GenBank（登录号：ON641839）。TMGMV-JS基因组全长6 356 nt，编码4个功能蛋白，分别为126K复制相关蛋白（72—3 407 bp）、183K复制酶（72—4 901 bp）、运动相关蛋白MP（4 891—5 661 bp）和外壳蛋白CP（5 667—6 146 bp）。

BLAST分析结果显示，TMGMV-JS核苷酸序列同源性与重庆TMGMV-TN29（MF139550）分离物最高，达99.83%，厦门分离物（JX534224）次之，同源性为99.76%。对TMGMV编码蛋白的同源性进行分析发现CP蛋白氨基酸序列同源性与其他分离物相对较高，达98.74%—100%；183K蛋白氨基酸序列同源性相对较低，为97.76%—99.88%（表2）。这表明CP蛋白相较于其他蛋白在进化上比较保守。为研究TMGMV-JS与其他分离物的进化关系，使用Clustal W对TMGMV-JS与其他TMGMV代表性分离物及烟草花叶病毒属其他成员的序列进行多重序列比对，利用MEGA7软件邻接法进行1 000次自导复制验证构建系统发育树，结果显示TMGMV-JS与已报道的TMGMV其他分离物归入同一个大分支，而与烟草花叶病毒属其他成员如番茄花叶病毒（tomato mosaic virus，ToMV）、番茄斑驳花叶病毒（tomato mottle mosaic virus，ToMMV）、烟草花叶病毒（tobacco mosaic virus，TMV）、辣椒斑驳花叶病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）、油菜花叶病毒（youcai mosaic virus，YoMV）归入不同分支；在TMGMV大分支中TMGMV-JS与重庆TMGMV-TN29分离物（MF139550）、厦门分离物（JX534224）共同聚于一个小分支，暗示其与这两个分离物亲缘关系较近（图1）。

表2 TMGMV-JS与9个分离物及其他5个烟草花叶病属病毒的核苷酸和氨基酸序列同源性

从NCBI中下载TMGMV不同分离物和其他烟草花叶病毒属病毒经典菌株的全基因组序列，用MEGA7软件采用邻接法构建系统发育树The genomes of TMGMV isolates and other classic strains of tobamoviruses were downloaded from NCBI. MEGA7 software was used to construct phylogenetic tree by neighbor-joining method. =: TMGMV Jiangsu isolate sequenced in this study

2.2 TMGMV侵染性克隆载体的构建

利用TMGMV基因全长引物TMGMV-ssF和TMGMV-ssR扩增获得约6 300 bp的目的条带，利用酶切位点I和I连接至pCB301载体上，经PCR检测和酶切验证获得农杆菌侵染性克隆载体pCB301-TMGMV-JS（简称为pTMGMV-JS）（图2）。

2×35S：CaMV 35S启动子CaMV 35S promoter；126K：126K复制相关蛋白126K replication-associated protein；183K：183K复制酶 183K replicase；MP：运动蛋白movement protein；CP：外壳蛋白coat protein；HDRz：核糖剪切酶hepatitis delta virus ribozyme；NOS：NOS 终止子NOS terminator；LB：左臂left border；RB：右臂right border

2.3 侵染性克隆载体在本氏烟上的致病性

为研究TMGMV-JS侵染性克隆是否构建成功以及在本氏烟上的致病特征，将pTMGMV-JS侵染性克隆通过农杆菌浸润法接种本氏烟，结果显示浸润后第5天，处理组本氏烟新叶出现斑驳，同时上部叶片伴随下卷、黄化等症状，第8天时，植株上部叶片出现萎蔫、坏死症状，植株表现系统性死亡，而对照组生长正常（图3-A）。

采集发病叶片，RT-PCR检测结果显示接种pTMGMV-JS的烟草可以检测到TMGMV特异条带，对照组未检测到目的条带（图3-B）。Western blot检测结果也显示接种pTMGMV-JS的本氏烟可检测到约18 kDa的CP蛋白，对照组未检测到目的蛋白（图3-C）。上述结果说明pTMGMV-JS侵染性克隆构建成功，同时也表明TMGMV-JS可以系统性侵染本氏烟，导致系统性坏死，表现出较强的致病性。

A：pTMGMV-JS侵染性克隆接种本氏烟第8天症状图，pCB301为对照组Symptoms of N. benthamiana inoculated by pTMGMV-JS infectious clone at 8 dpi, pCB301 was the negative control group；B：RT-PCR检测结果（8 dpi） RT-PCR detection at 8 dpi. M: DL5000 DNA marker；C：Western blot检测结果（8 dpi）Western blot detection at 8 dpi. M: Protein marker

2.4 侵染性克隆载体在辣椒上的致病性

为研究TMGMV-JS在辣椒上的致病性，将pTMGMV-JS侵染性克隆通过农杆菌注射辣椒茎秆，结果发现接种14 d后辣椒上部叶片出现黄化、下卷等症状，有些病株伴有叶基部出现褐色坏死斑，植株矮小等症状（图4-A、4-B），接种30 d后，辣椒出现叶片斑驳，下卷等症状，植株伴有轻微矮化（图4-C）。采集发病叶片，经RT-PCR和Western blot检测结果显示，接种pTMGMV-JS的辣椒样品可以检测到目的条带，对照组未检测到目的条带（图4-D、4-E）。上述结果表明构建的pTMGMV-JS侵染性克隆成功，同时也说明TMGMV-JS可以系统侵染辣椒，并引起叶片斑驳、下卷等症状。

3 讨论

3.1 TMGMV江苏辣椒分离物基因组序列分析

本研究通过整段扩增法获得了侵染江苏南京辣椒的TMGMV全基因组，明确了TMGMV-JS分离物全长6 356 nt，编码4个功能蛋白：126K、183K、MP和CP。TMGMV-JS分离物与中国重庆分离物的同源性最高，厦门分离物次之，而与美国、斯洛文尼亚、意大利、巴西、日本等国外分离物的同源性较低，相对远缘，同时分析结果也显示TMGMV-JS与中国长沙分离物（98.36%）、中国台湾分离物（97.11%）之间的同源性也相对较低，暗示了我国TMGMV可能存在较多的变异类群，因此针对区域TMGMV的群体展开调查，明确优势病毒群体，对于病毒的有效防控具有重要指导意义。

3.2 TMGMV江苏辣椒分离物侵染性克隆载体的构建

构建侵染性克隆是研究植物病毒的致病特征、病毒与寄主互作方式的重要手段，目前常用的手段有两种，一种是将病毒基因组构建到T7等原核启动子下，通过体外转录进行侵染；另一种是将病毒基因组构建到35S等启动子下，通过农杆菌介导的方式进行侵染。本研究利用含有2×35S启动子的pCB301载体，构建了TMGMV-JS的侵染性克隆，并通过农杆菌浸润法接种本氏烟和辣椒，研究TMGMV-JS的致病性，发现TMGMV-JS导致本氏烟系统性坏死；而辣椒出现明显的斑驳，叶片下卷等症状，同时在实验室内还观察到发病辣椒伴有明显的叶片早脱落现象。目前国外也有TMGMV侵染性克隆相关报道，但多是通过T7启动体外转录的方式实现[23-25]，如Morishima等[26]将TMGMV-J日本分离物构建到T7启动子下，通过体外转录的方式对其致病性进行研究，发现TMGMV-J可以系统侵染辣椒和烟草，导致普通烟局部坏死症状。本研究发现TMGMV-JS也可以系统侵染辣椒和烟草，且在本氏烟上会导致坏死症状，但相较于体外转录的方式，农杆菌介导的接种方式无需体外RNA转录，操作更方便，也更经济，为后续深入解析TMGMV的致病机理提供了便利。

3.3 TMGMV致病性分析

TMGMV是烟草花叶病毒属的重要成员，已有多地报道其侵染危害辣椒、烟草等作物。Font等[13]报道TMGMV摩擦接种辣椒后会引起叶片轻微褪绿等症状；Li等[17]在研究我国台湾分离物（TMGMV-HP）时，发现TMGMV可以侵染多种烟草，其中在本氏烟上会表现系统性褪绿症状，在辣椒上起初叶片表现轻微褪绿，而后出现坏死、叶片脱落症状。而本研究在分析TMGMV-JS致病性时发现其在本氏烟上会引起系统性坏死，而在辣椒上未观察到坏死症状。这些结果暗示了不同分离物在致病性上可能存在差异，而TMGMV-JS与TMGMV-HP基因组核苷酸序列的同源性仅97.11%，这种基因组上的差异可能是导致接种症状出现差异的重要原因之一，因此针对本地病毒分离物群体进行研究对于解决区域问题具有重要意义。

A、B：pTMGMV-JS侵染性克隆接种辣椒第14天症状图，pCB301为对照组Symptoms of C. annuum inoculated by pTMGMV-JS infectious clone at 14 dpi, pCB301 was the negative control group；C：pTMGMV-JS侵染性克隆接种辣椒第30天症状图 Symptom of C. annuum inoculated with pTMGMV-JS infectious clone at 30 dpi；D：RT-PCR检测结果（14 dpi）RT-PCR detection at 14 dpi。M: DL5000 DNA marker；E：Western blot检测结果（30 dpi）Western blot detection at 30 dpi。M: Protein marker

TMGMV在不同寄主作物上导致不同的症状，暗示TMGMV对不同作物造成的威胁存在差异，利用构建的侵染性克隆可以快捷地评估病毒对作物的危害，研究病害的发生规律，有针对性地筛选抗性品种或者实施阻断措施，为病害的有效防控提供支撑。辣椒在我国多省份均有种植，目前报道的可以侵染辣椒的病毒种类繁多，且常出现复合侵染，其中烟草花叶病毒属就有多种病毒[27]。烟草花叶病毒属的病毒可以通过摩擦传播，在田间农事操作过程中极易传播扩散，同时也可以通过种子传播，随着种苗调运等途径远距离扩散危害。TMGMV属于烟草花叶病毒属，本研究的结果显示其可以单独侵染辣椒并危害，虽然目前尚不清楚TMGMV与其他病毒复合侵染是否会造成更大的危害，但鉴于其具有机械传播和种传特征，扩散流行威胁极大，生产上应密切关注，加强种苗监测，早发现，早防控，减少TMGMV对产业健康发展造成的危害。

4 结论

烟草轻绿花叶病毒江苏辣椒分离物（TMGMV- JS）基因组大小6 356 nt，与重庆TMGMV-TN29分离物同源性最高，厦门分离物次之。成功构建TMGMV- JS的侵染性克隆并测定了其致病性，发现TMGMV-JS可系统侵染本氏烟，导致系统性坏死；而在辣椒上TMGMV-JS侵染导致辣椒出现叶片斑驳、下卷等症状。

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Construction of an infectious clone of Tobacco mild green mosaic virus isolate infecting pepper from Jiangsu based on genomic clone

1Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014;2College of Agriculture, Yangtze University/Hubei Engineering Research Center for Pest Forewarning and Management, Jingzhou 434025, Hubei

【Objective】is one of the main viruses that infect Solanaceae crops such as pepper and tobacco, which seriously affects the cultivation and production of crops. The purpose of this study is to investigate the genomic structural characteristics, phylogenetic relationship and pathogenicity of tobacco mild green mosaic virus (TMGMV) isolate infected pepper in Nanjing City of Jiangsu Province (TMGMV-JS), and to provide a scientific basis for the prevention and control of TMGMV. 【Method】Total RNA was extracted from disease pepper samples, then the positive samples were confirmed by specific detection primers of TMGMV. Subsequently, a pair of primers were designed and used to amplify the full-length genome sequence of TMGMV-JS isolate. The infectious cDNA clone of TMGMV-JS isolate was obtained by cloning the amplified products into pCB301 vector by homologous recombination. Then the homology of TMGMV-JS isolate with reported isolates was analyzed by BLAST and the neighbor-joining method of MEGA7 software was used for the phylogenetic analysis.andwere infiltrated with the infectious cDNA clone mediated by. Furthermore, RT-PCR and Western blot were determined to define the pathogenicity of TMGMV-JS isolate.【Result】TMGMV-JS isolate contains 6 356 nt, encoding four functional proteins, 126K replication-associated protein, 183K replicase, movement protein MP, and coat protein CP. Homology analysis showed that TMGMV-JS isolate shared the highest identity with Chongqing TMGMV-TN29 isolate (MF139550), followed by Xiamen isolate (JX534224). Phylogenetic analysis showed that TMGMV-JS was clustered in a big branch with other TMGMV isolates and relatively closed to Chongqing and Xiamen isolates in a small branch. Furthermore, the constructed pCB301-TMGMV-JS infectious cDNA clone can systematically infect, causing leaf yellow and systemic necrosis symptoms. It can also systematically infect, causing symptoms such as leaf mottle, curling and dwarfing symptoms. 【Conclusion】The full-length genome of TMGMV-JS isolate infectingfrom Nanjing City, Jiangsu Province is 6 356 nt, which is closely related to Chongqing and Xiamen isolates and belongs to the same branch. Significantly, the constructed infectious clone of TMGMV-JS can systemically infectand, causing systemic necrosis symptoms on.

tobacco mild green mosaic virus (TMGMV); molecular characteristic; infectious clone; pathogenicity analysis

2023-01-16；

2023-02-07

国家重点研发计划（2022YFD1401202）、国家自然科学基金（32072506）、江苏省农业科技自主创新基金项目（CX(21)1011）、国家现代农业产业技术体系（CARS-24-C-01）、沿海集团揭榜挂帅（2022YHTDJB03）、高端外国专家引进计划（G2022014073L）

高晓晓，E-mail：2424054181@qq.com。通信作者季英华，E-mail：jiyinghua@jaas.ac.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.08.006

（责任编辑 岳梅）