浅谈癌胚抗原及其检测方法

郭旭，蔡燕，陈婷婷，姚勇，王 锦

（南通大学 化学化工学院，江苏 南通 226019）

癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是一种广谱性的肿瘤标志物，其测定可以用于多种肿瘤的临床检测[1]。CEA 在1965 年首次由Gold 和Freedman 在人的癌变结肠组织中发现，被认为是由胚胎组织或胎儿胃肠道上皮组织、胰和肝的细胞合成，是一种具有人类胚胎抗原特性的酸性糖蛋白。又由于胚胎的胰腺、肝脏、消化道上皮组织中都有它的存在，因而被命名为CEA[2]。CEA 普遍存在于由内胚层细胞分化而来的癌细胞表面，是细胞膜的结构蛋白。能分泌CEA 的肿瘤多位于呼吸道、消化道、泌尿道等，因此，在血清、胃液、尿液等体液和排泄物中都可以检测到CEA 的存在[3-4]。受癌细胞侵犯部位的分泌液中CEA 浓度高于血清中[5]，当用这些体液检测CEA时，容易出现高阳性检出，所以通常用血清作为CEA 的检测样本。实践表明，CEA 在血清中的异常增高会早于临床症状，健康成人血清中CEA 的平均含量通常小于5 ng/mL；虽然某些疾病会导致CEA 指数略微升高，但若血清中CEA 水平高于20 ng/mL，则意味着存在肿瘤的可能，包括肺癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌和卵巢癌等[6-7]。

部分学者发现CEA 水平与肿瘤大小、肿瘤侵犯深度相关[8]，当肿瘤直径、负荷增大时，CEA 水平常升高，因此，监测CEA 水平也可以作为术后肿瘤是否残存的判断依据[5]。通过检测人血清CEA 浓度来判断患者是否患有癌症，具有无创口、安全系数高、可重复操作等优点，可作为临床诊断的常用辅助手段[9]。分析CEA 浓度高低的结果，并不是意味着直接证明了恶性肿瘤的存在，需要考虑患者自身因素以及各种因素对测试结果的影响，结合其他检测方法，作出正确诊断。因此，为了实现癌症的及时诊断，开发能准确、快速检测血清中CEA 浓度的检测方法十分重要。

在血清中检测CEA 的方法很多，如放射性免疫分析法[10-11]、酶联免疫吸附法[3，12]、荧光免疫分析法[13]、电化学发光法[14-15]、电化学免疫检测法[16]、光电化学检测法[17-19]等。其中，如放射性免疫分析法、酶联免疫吸附法、荧光免疫分析法等，因为使用了荧光分子、放射性元素或酶等作为特定标记，有较好的选择性，可以将抗原和抗体结合物的结合信息转化为可读信号，拥有良好的检测效果。电化学反应易于量化，比如使用安培检测法，因其线性范围大、灵敏度高、检测限低而具有较大的优势。光电化学检测法是在电化学检测法的基础上发展起来的，具有分析性能好、操作简单、响应快速、灵敏度高等优点。光电化学检测过程中，光活性材料在可见光照射下识别待检测分子产生光生电子和空穴，并以电荷的转移产生光电流作为检测信号[19]。由于输入（光）和输出（电）信号不同，光电化学检测法具有较低的背景信号[18]，因此，该方法具有优异的灵敏度，可以实现对目标分析物的超灵敏检测。本文将基于这些检测策略对CEA 的分析和检测进行总结。

1 癌胚抗原传统检测方法

传统的CEA 检测方法，包括荧光免疫分析法、放射性免疫分析法、酶联免疫吸附法等。大多数已开发的免疫分析法都依赖于特定标记，如放射性免疫分析法需要对抗体进行同位素标记，虽然具有灵敏度高、特异性强、标记效率高等优点，但是需要抗原抗体有高活性和高纯度，而且处理放射性免疫分析法的废料有一定风险。酶联免疫吸附法既拥有酶的高效催化性又拥有抗原抗体结合的特异性，使得检测更加灵敏、特异，其劣势是操作繁琐。荧光免疫分析法虽然成本较低，但需要选取合适材料与CEA产生荧光才能进行进一步研究。

1.1 荧光免疫分析法

荧光免疫分析法，如利用金属纳米颗粒具有良好的荧光特性，通过CEA 抗体或者CEA 适配体对金属纳米颗粒修饰，使其对待测物质（如CEA）具有特定的选择能力。由于待测物质的浓度与金属纳米颗粒的荧光强度相关，可实现对CEA 的特定检测，浓度可以通过构建标准曲线来确定。基本原理如图1 所示。

图1 荧光免疫分析法检测癌胚抗原的机理图Fig. 1 Mechanism diagram of CEA detection by fluorescence immunoassay

陈明建团队[13]提出一种基于双链DNA 模板化的铜纳米颗粒（Cu NPs）与CEA 特异性适配体结合的荧光检测方法。首先，在互补脱氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）、CEA 适配体和Cu2+的存在下，添加抗坏血酸以产生双链DNA 模板化的Cu NPs，产生强烈荧光。当CEA 存在于系统中时，CEA 可以稳定地与其适配体键合，阻止双链DNA 模板化的Cu NPs 的形成，这意味着反应体系不会产生任何荧光，荧光强度随着CEA 浓度的增加而降低。因此，荧光免疫分析法可以较灵敏地检测CEA 的浓度。

1.2 放射性免疫分析法

传统的检测方法中，放射性免疫分析法较之其他方法，不仅具有较高的特异性，而且具有放射性检测灵敏度高的优点。因此，通过使用放射性免疫分析法可以做到较准确地测定一些物质。其不足之处是由于只能使用免疫反应来测定具有免疫活性的物质，不能检测具有生物活性或者免疫活性丧失的物质。由于需要借助其他生物试剂，所以许多因素都会影响到检测的稳定性，这将导致需要采取其他措施来确保检测结果的可靠性。此外，放射性免疫分析是一种竞争反应，其中被测物质以及对照物质都不能参与反应，所以通过放射性免疫分析法测得的CEA 的结果是相对量而不是绝对量。最重要的是，该方法会产生辐射和污染，可能使操作人员暴露于潜在的危险中，并需要特殊的废物处理。

其检测的基本原理如图2 所示。待测物中的抗原物质（Ag）与其标志物（Ag*）和特异性抗体（Ab）之间存在竞争性结合，因为Ab 的数量是恒定的，Ag的增加将减少Ag*·Ab 结合物的数量，所以放射性降低。待测物中抗原（Ag）的含量越高，最终结合物的放射性越低。如果结合物的放射性测量值较低，则表明待测物质的浓度较高。通过对标准曲线的分析，可以计算出被测物质的浓度。

图2 放射性免疫分析法检测癌胚抗原的机理图Fig. 2 Mechanism diagram of CEA detection by radioimmunoassay

非竞争性免疫分析法是指先标记抗体，将其与待测抗原结合形成抗原抗体结合物，然后测量结合物的辐射计数的方法。非竞争性免疫分析法有单位点法和双位点法两种：单位点法是先将过量标记抗体与待测抗原结合，反应平衡后，用固相抗原去除未结合的标记抗体（固相是指用聚苯乙烯塑料包裹抗原或者抗体），通过检测标记抗体与待测抗原结合物的放射性来分析待测物质的浓度；双位点法是先用固相抗体与待测抗原反应结合，然后使用过量的标记抗体进行标记，最终形成固相抗体-待测抗原-标记抗体结合物，最后，通过检测结合物的放射性来分析待测物质的浓度。

Kim 团队在1978 年提出固相放射免疫法测定血清或血浆中CEA 水平[20]。通过高氯酸提取样品，然后用碱性缓冲溶液快速中和多余的酸；用抗体包覆的塑料管和放射标记的CEA 抗体作为标志物对高氯酸提取物进行检测。其中结合的标记抗体与样品中CEA 的含量成正比，实现了对CEA 的灵敏性检测。

1.3 酶联免疫吸附法

大多数临床蛋白质生物标志物可以通过酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）检测[3]，CEA 属于蛋白质，可作为生物标志物。ELISA 通过将抗体和酶结合，利用显色检测的方法，实现对体液中的微量物质进行测定。检测的主要步骤是：首先，将一组抗原或抗体结合到固相载体的表面，并维持结合抗原或抗体的免疫活性；其次，用酶与另一组抗原或抗体连接形成酶标记抗原或酶标记抗体，在测定过程中，待测样品（待测抗体或抗原）和酶标记抗原或抗体以及固相载体表面的抗原或抗体发生反应；再次，通过洗涤将固相载体上形成的抗原抗体结合物与其他物质分离；最后，由于结合在固相载体上的酶的数量与样品中待测物质的含量成正比，添加酶反应的底物后，酶催化底物产生有色产物，有色产物的含量与样品中待测物质的含量直接相关，因此，可以根据反应颜色的深浅进行定性分析。此外，可以通过加入终止液和使用酶标仪进行定量分析。由于酶的特异性和高效性，该方法具有较高的灵敏度。

黄国庆团队基于ELISA，通过使用胶体金免疫层析技术，开发了一种CEA 胶体金检测方法[21]。用这种胶体金制备CEA 胶体金免疫层析检测试纸条，当CEA 的浓度低于5 ng/mL时，试纸会显色；随着CEA 浓度增加，检测线颜色逐渐降低。这种试纸对CEA 标准溶液在0～100 ng/mL 都有较好的线性关系，且重复性和稳定性也都较好。

目前，ELISA 不仅技术复杂而且价格昂贵。因为需要使用酶标记的抗原或抗体，且并不是所有抗原或抗体都适合标记，所以酶联标记的成本相对较高。如果使用两种抗体进行分析，抗原需要有两个以上的抗体结合位点，而且交叉反应也将影响其特异性检测。因此，开发一种简便、快速、低成本且安全的蛋白质生物标志物检测方法具有重要意义。

2 癌胚抗原光/电化学检测方法

近年来，电化学检测法因其灵敏度高、响应快速、设备小型化等优点而备受关注。核酸适配体因为具有易修饰、可重复使用、不同批次间无差异、功能类似于抗体、相对分子质量小等优点，被认为是传感器理想的识别元件。通过结合电化学检测法以及核酸适配体，构建电化学适配体传感器，可以实现对CEA 选择性检测。光电化学检测法区别于电化学检测法[22]，通过光活性材料在可见光激发下产生光生电子，并以电荷的传递产生光电流作为检测信号。此外，也可以在材料上修饰光活性物质，增强对待测物质的选择性以及检测过程中电荷的转移速率等，放大检测信号，提高检测灵敏度，实现对CEA超灵敏检测。

2.1 电化学发光法

电化学发光（electrochemiluminescence，ECL）是通过电极表面发生电化学反应引起的特异性发光，包括电化学和发光两个过程。如罗氏电化学发光技术，其基本原理是：在一定的电压下，三联吡啶钌和三丙胺被阳极电极氧化，失去电子；而被氧化的三丙胺阳离子自由基由于不稳定，会自发失去一个H+，变成强还原剂，并将一个电子给[Ru（bhy）3]3+，使它变回[Ru（bhy）3]2+，并处于激发态；处于激发态的[Ru（bhy）3]2+会发生衰减并释放出一个光子，而后变为基态。这种化学反应过程会一直在电极表面重复，产生许多光子，增强光信号。ECL 法检测CEA的原理就是用三联吡啶钌或者N-羟基琥珀酰胺酯作为标志物，通过化学反应标记CEA，制成标记抗原，检测模式与ELISA 类似。

构建ECL 适配体传感器的策略主要有两种：一种是使用CEA 适配体连接ECL 基团，将CEA 的cDNA 序列修饰到电极材料上，而后CEA 适配体会与cDNA 杂交，使它们相连接，并发生ECL。当体系内有CEA 存在时，CEA 会与cDNA 竞争CEA 适配体，导致发光基团远离电极，发光强度降低。另一种是用CEA 适配体连接发光抑制基团，而发光基团在电极上，并连着cDNA 序列。正常情况下，CEA 适配体会与cDNA 杂交进而使ECL 猝灭，但当体系内存在CEA时，CEA 会与cDNA 竞争CEA 适配体，使得发光抑制基团从电极上移除，ECL 恢复发光。

发光基团功能化贵金属纳米颗粒可以增强其ECL 信号和自然吸收波长，从而被广泛关注。例如鲁米诺金是一种众所周知且被广泛使用的阳极ECL 发射器，而硫化镉掺杂碳量子点复合材料（CdSC）则用作阴极ECL 发射器。通过改变材料可以改变ECL 的发光强度，进而构造不同的传感器。

曹俊涛团队[14]使用供体/受体对，即硫化镉掺杂碳量子点/鲁米诺金纳米颗粒（CdS-C/L-Au NPs），来触发RET 策略，并将其引入ECL 系统，以构建ECL适配体传感器。利用金纳米颗粒的自然吸收截面和催化效应可以在一次电位扫描中诱导CdS-C NFs的信号猝灭和鲁米诺金的信号增强。在该传感器中，CdS-C NFs 的阴极ECL 信号随CEA 浓度的增加而增强，而光激发的阳极ECL 信号则相应减弱。利用这种新的ECL-RET 策略，通过鲁米诺金纳米颗粒的阳极ECL 信号与CdS-C NFs 的阴极ECL信号之比，ECL 适配体传感器对CEA 具有优异的分析性能，其范围为0.1 pg/mL～10 ng/mL，检测限为0.033 pg/mL。刘福饶团队[15]使用CdS-C 复合材料作为阴极ECL 发射器，使用L-Au NPs 作为阳极ECL发射器，分别固定在双盘玻碳电极的两个工作电极上。Ag-PAMAM-bio-apt 通过SH-cDNA 与两个电极连接，导致两个电极的ECL 猝灭，然后用cDNA 和CEA 竞争Ag-PAMAM-bio-apt，变成Ag-PAMAM-bio-apt-CEA，使ECL 信号增强。两种电极都能较灵敏地检测CEA。

2.2 电化学免疫检测法

电化学免疫检测法是一种将生物信号转化为电化学信号的检测方法。通过将抗体负载到电极的表面或者衬底材料之上，借助特异性抗原和抗体相互结合后，溶液界面以及电极表面之间的电子转移速率发生变化，产生膜电位[3，23-24]，引发电流响应变化，再次通过转换系统将响应信号转换成可以识别的电流、电压、电阻等电信号。因为随着检测物（比如CEA）浓度的变化，电信号强度也随之发生改变，所以通过对数据进行处理，可以对目标分析物进行定性或者定量分析。当然，电化学免疫检测中，能够直接检测的抗原或者抗体往往不多，通常需要给抗原或抗体连接一个具有氧化还原性能的标志物，以便通过电化学的方法检测。标志物有两类：电化学活性物质或者生物酶。但是，选择的生物酶需要满足高活性、在易与待测物结合的基础上活性不降低、在检测过程中以及保存环境下稳定性好等条件；而电化学活性物质则是具有电化学氧化还原性质的金属离子或者具有电活性的有机功能基团。所以，选择合适的标志物标记CEA 对于电化学免疫检测法检测CEA 无比重要。

顾雪芳团队[6]使用二茂铁（ferrocene，Fc）作为氧化还原继电器，利用金纳米颗粒的局域表面等离子体共振（local surface plasmon resonance，LSPR）效应增强了电子转移，放大了电信号，构建了一个三明治适配体传感器来检测CEA。首先，Fc 分子与巯基（—SH）结合，并通过金和硫原子之间的共价键固定在金纳米表面，然后与抗体（Ab2）结合，形成Fc-Au NPs-Ab2 纳米探针。硫辛酸N-羟基琥珀酰亚胺酯单层被用作金电极和CEA 抗体（Ab1）之间的连接器。最后，在CEA 抗原中培养形成Fc-Au NPs-Ab2-CEA-Ab1，并修饰于金电极，用于电化学检测CEA，由于氧化还原电流随着CEA 浓度的增加而增大，所以，可以实现对CEA 的特异性检测。

2.3 纳米孔检测法

固体纳米孔在单分子检测、DNA 测序、生物传感器、能量转换、纳米粒子分离等领域引起了人们极大的兴趣[25]。用固体纳米移液管检测单个蛋白质分子也得到了广泛的研究。其原理是在纳米孔两端施加外加电场，借助对电解液流经纳米孔时微弱电流信号（包括变化频率、幅度和指纹信号）进行监测，根据其变化，可以判断穿过纳米孔的离子或分子的浓度、电荷和结构特征，因此，可以实现对CEA的检测。然而，当前大多数分析物是在没有任何干扰物质的纯溶液中进行研究的[25]，如何以高灵敏度检测复杂样品（比如人血清中的CEA）仍需进一步研究。

唐浩然团队[25]设计了一种以DNA 适配体功能化磁性核壳Fe3O4@Au NPs（Apt-MNPs）为载体，通过组合和人工磁分离过程，从复杂样品中快速分离CEA，并通过组合固体纳米孔，实现对CEA 的检测。鉴于适配体与CEA 之间的特异性识别，CEA 添加到Apt-MNPs 中将产生3 种产物，其中Apt-MNPs和CEA-Apt-MNPs 可以通过正电位转移到纳米孔中。由于CEA-Apt-MNPs 和Apt-MNPs 之间的粒径存在明显差异，因此，可以通过电流下降的程度完全区分相应的阻塞信号。此外，在一定范围内，CEAApt-MNPs 阻断信号的频率与CEA 浓度成正比，可以实现复杂样品中CEA 的定量检测。

2.4 基于局域表面等离子体共振检测法

可见光照射下，金和银等贵金属纳米颗粒会发生LSPR 效应，可以增加电化学反应速率，进而增强光电流，提高光电传感器检测CEA 的性能等。如姚勇团队[18]利用BiOBr 在可见光照射下产生光生空穴增加电荷转移和提高氧化性能，以及聚苯胺空心管能快速电子转移的基础上，利用金纳米颗粒的LSPR 效应和水溶性柱五芳烃与抗坏血酸的主客体络合增加光电流信号，结合CEA 适配体等，构建光电化学适配体传感器实现对CEA 的超灵敏性检测。

贵金属纳米颗粒在紫外可见光范围内会出现很强的吸收光谱，因此，可以获得LSPR 光谱。材料的微观结构特性会影响该材料吸收光谱峰值处的吸收波长，加上LSPR 吸收谱对周围介质极其敏感，因此，在周围介质中加入CEA，然后研究LSPR光谱，并对其进行分析，可以构建基于光学信号的CEA 检测传感器。例如李青枫团队提出一种基于LSPR 的光子晶体光纤传感器用于CEA 的检测[26]，利用等离子体和光子晶体光纤及核酸适配体修饰后传感器表面折射率的变化，进一步使光纤的共振波长产生移动。随着CEA 的加入，CEA 核酸适配体会与CEA 分子发生特异性识别并捕获CEA 分子，使传感器表面的折射率进一步变化，而且不同浓度的CEA 分子产生的折射率变化量不同。研究发现，共振波长与CEA 浓度有良好的线性关系，因此，可以实现对CEA 浓度的定量检测。

2.5 光电化学适配体传感检测法

光电化学适配体传感检测法具有光学和电化学方法的优点，此外，还具有超低的背景信号和优异的灵敏度，具有很高的应用价值。光电化学适配体传感器可以用来检测DNA、CEA 或其他生物小分子。与ECL 过程相比，光电化学检测法是相反的。其原理是利用光激发电极上的活性物质，用CEA 适配体来识别CEA；以光电流为检测信号，通过分离激发源和检测信号，可以有效去除背景噪声，实现对CEA 的超灵敏检测。

韩志忠团队[7]利用g-C3N4-Au NPs 纳米杂化修饰的ZnO 花棒结构、p 型半导体CuS 和CEA 适配体，构建了一种光电化学自适应传感器，用于高灵敏度和选择性地检测CEA。在可见光照射下，金纳米颗粒的LSPR 效应可以提高光电流的传输速度，并使用g-C3N4金纳米颗粒和金纳米颗粒杂化改性的ZnO 花棒结构来提高其光电化学效率和扩大可见光吸收范围。通过p 型半导体CuS 作为一个足够的能量受体来捕获光生电子并加速电子-空穴对的复合，当CEA 存在于系统中时，结构被破坏，CuS捕捉电子的能力降低，光电流恢复；随着CEA 浓度的增加，光电流强度增加。根据此规律可以构建灵敏的光电化学适配体传感器，实现对CEA 的高效、快速检测。表1 列举了几种CEA 检测方法的检测结果。

表1 几种癌胚抗原检测方法的检测结果分析Tab.1 Analysis of the testing results based on different CEA detection methods

3 结论

CEA 是一种肿瘤标志物，监测其浓度在恶性肿瘤的诊断、治疗、药效评价等方面有重要的临床价值。本文综述了CEA 主要检测方法的研究进展，重点介绍了检测方法、原理和各种检测方法的优缺点。CEA 传统的检测方法如免疫分析技术，通过用荧光分子、放射性元素、酶以及其他免疫活性物质作为特定标记，分别依据荧光强度、放射性强度或酶反应的底物颜色深浅来分析CEA 浓度。但是这些标志物的选取、使用、保存处理都会影响对CEA 浓度的分析，而且废料的处理比较麻烦。电化学检测法以其响应快速、操作简单、价格低廉等优点而备受关注，然而，难以选取合适的发光材料、用于标记CEA 的纳米探针易丢失，以及修饰在电极表面的免疫活性物质导电性差等缺点限制了其检测性能。目前，在电化学检测法基础上发展的光电化学检测法不仅同样操作简单且价格低廉，由于输入和输出信号不同，具有更高的检测灵敏度，结合适配体识别CEA，能实现对CEA 超灵敏检测。但是，光电化学检测法还处于实验阶段，在实际应用方面的探索将是它未来发展的一个重要方面，相信在众多科研人员的努力下，未来检测CEA 的方法将日臻完善，CEA传感器将会向更加自动化、更高灵敏度、更微型化以及集成化方向发展。