拟南芥AtGST8 的功能及其过表达植株对甲基紫精胁迫的响应

王玲娟，鲁帅，高聪，韩缤莹，赵成磊，薛鹏辉，曹云英

（南通大学 生命科学学院，江苏 南通 226019）

谷胱甘肽S-转移酶（glutathione transferase，GST）是一个蛋白质超家族，包含多个基因类型，它们具有还原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）的结合域和催化结构域，可催化GSH 与底物连接，形成水溶性产物，从而达到解毒的目的[1]。植物受到不良环境、病原微生物侵染、重金属毒害等非生物胁迫时，细胞器容易受损，体内的GST 会被诱导表达[2-4]，从而保护植物免受或减轻伤害。植物在生长发育过程中受到不利条件时会引起氧化应激反应，从而破坏植物内的氧化还原平衡，导致活性氧（reactive oxygen species，ROS）的积累[5]。植物主要通过酶促和非酶促两大抗氧化系统及时清除ROS，调节氧化还原平衡，从而使植株免受伤害。谷胱甘肽和抗坏血酸（AsA）等低分子量化合物组成非酶促抗氧化系统，它们不仅可以直接与ROS 反应，还可以作为一些抗氧化保护酶的底物去除体内的ROS[6]。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）和GST 等多种保护酶组成酶促抗氧化系统[7-8]。此外，一些GST 具有GSH-Px 活性，能够将氢过氧化物转化为羟基醇类物质，防止组织中的氢过氧化物降解形成对植物细胞有毒害作用的产物——乙醛衍生物[9]，从而抑制由氧化伤害引起的程序性细胞死亡[10]。

植物中GST 家族成员目前可分为10种，其中phi（GSTF）、tau（GSTU）和脱氢抗坏血酸还原酶等是植物所特有的[11]。tau 类在植物中成员最多[12]。拟南芥目前已经鉴定了48 个GSTs 基因[13-14]，大多属于phi 和tau 类[15]。研究表明GST 基因在发育和胁迫响应中发挥重要的作用，据报道，过表达GST 能增加植物对低温、盐和除草剂的耐受性，转基因植物的生长也发生了变化[16-17]。GST8 已从干旱胁迫的拟南芥中分离出来，根据序列相似性推测其属于tau类，又称为GSTU19[18]，但GST8 在拟南芥中的定位及组织中的表达情况目前尚不清楚。甲基紫精（methyl viologen，MV）又称百草枯二氯化物，是一种触杀性的除草剂[19]。有报道过表达GST8 可以提高拟南芥对盐和干旱等胁迫的耐性，但对MV 的响应及其机理仍不清晰。为此，本研究中首先构建了该基因的绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）融合蛋白载体，确定其亚细胞定位；其次构建了带有该基因启动子的β-葡萄糖苷酸酶（beta glucuronidase，GUS）融合蛋白载体，运用GUS 染色和实时荧光定量PCR 技术，明确其在拟南芥组织中的表达；最后构建了过表达AtGST8 载体并获得了过表达AtGST8植株，然后通过生理测定、组织染色和基因表达分析，以明确该基因在拟南芥幼苗受到MV 处理后的作用，旨在为抗性材料的选育提供理论依据。

1 材料及方法

1.1 植物材料和生长条件

拟南芥种子先后经体积分数为75%的酒精和体积分数为20%的漂白剂消毒、无菌水洗涤，然后将其均匀铺在含有质量分数为1%的蔗糖和质量分数为0.7%的琼脂的1/2 MS 培养基上。在4 ℃冰箱中春化处理2 d 后移至光照培养箱（全友，南京）中生长，其中昼/夜光周期为14 h/10 h，温度为22 ℃/20 ℃，湿度恒定为80%±5%。

1.2 亚细胞定位

AtGST8全长编码序列（coding sequence，CDS）是从提取拟南芥植株中的总RNA（Total RNA Isolation System Kit，Promega）开始，再以逆转录的cDNA为模板，使用序列特异性引物（5'-CACCATGGCGA ACGAGGTGATTCTTCTT-3'和5'-TTACTCAGGT A CAAATTTCTTCCTGAGC-3'）扩增而获得。采用Gateway法将其先通过BP 反应构建到入门载体pENTR/DTOPO（pENTRTMDirectional TOPOCloning Kits）中，再通过LR 反应（LR ClonaseTMⅡEnzyme Mix）将其构建到过表达载体pMDC43（12 460 bp）中，获得AtGST8基因的GFP 重组质粒（AtGST8-GFP）。将重组质粒导入根癌农杆菌GV3101中，再将菌液注射到烟草下表皮，黑暗下培养3 d，最后通过激光共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）观察AtGST8在细胞中的定位情况。

1.3 组织表达分析

选择野生型拟南芥Col-0植株1 月龄的叶片提取总DNA（DNA quick Plant System，Tiangen），使用特异性引物（5'-CACCGCCACGTAATACAGTGCGTA GGGT-3'和5'-CTGGAGAAGCAAAGGACTCTTGTT CC-3'）进行PCR 扩增带有AtGST8基因的启动序列的产物。通过Gateway 法构建AtGST8pro:GUS载体（方法同AtGST8-GFP），表达载体为pMDC163（12 833 bp）。将重组质粒通过浸花转化法获得转基因植株[20]，潮霉素筛选获得带有GUS 报告基因的阳性植株。将不同生长阶段的阳性植株的各组织进行GUS 染色[21]，所有染色均平行进行3 次。同时通过荧光定量技术分析了野生型各组织中AtGST8的表达水平[22]。

1.4 过表达植株的获得、鉴定及处理

以AtGST8cDNA 为模板，使用特异引物（序列同AtGST8-GFP），通过Gateway 法将AtGST8转到表达载体pMDC32（11 752 bp）中，获得带有AtGST8基因的阳性过表达植株，以T2 代苗进行鉴定并作MV处理，采用荧光定量PCR 技术进行鉴定。将野生型Col-0及过表达AtGST8株系OE-24和OE-443 周龄的幼苗用含20 μmol/L MV 的MS 营养液浇灌，生理指标和基因表达的分析采用处理3 d 后的幼苗来进行。

1.5 生理指标的测定

APX 酶液采用50 mmol/L、pH=7.0 的PBS 提取，酶活性测定参照文献[29]的方法。CAT 和过氧化物酶（peroxidase，POD）的酶液采用50 mmol/L、pH=7.8 的PBS 来提取，活性测定参照文献[24]的方法。采用WST 法测定SOD 活性，SOD 和GSH-Px 酶液的提取及测定参照试剂盒（建成，南京）来进行。GST酶活的测定参照文献[30]并作修改，采用pH=6.5的PBS 来提取酶液，反应体系包括0.1 mL 酶液、0.8 mL浓度为10 mmol/L 的1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）、2 mL PBS 及0.1 mL 浓度为10 mmol/L 的GSH。将每分钟每毫克蛋白质样品OD 减少或增加0.01 定义为CAT 或POD 的1 个活力单位（U）；将每小时每克鲜重样品抑制NBT 光化还原50%所需的酶量定义为SOD 的1 个酶活单位（U）。

1.6 基因表达分析

AtGST8和保护酶系统相关基因的表达采用荧光定量技术来进行。样品经液氮研磨，用TRIZOL（Invitrogen）法提取总RNA，用第一链cDNA 合成试剂盒（Roche）获得cDNA。以ACT2（At3g18780）为内参基因，参照文献[22]的方法，通过荧光定量PCR 分析其基因表达水平，具体引物序列见表1。

表1 荧光定量表达分析用的引物序列Tab.1 Primer sequences for fluorescence quantitative expression analysis

1.7 统计分析

使用SPSS 软件版本20.0 进行数据分析，使用Duncan's 法进行差异显著性检验（P＜0.05），使用OriginPro8 进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 AtGST8 基因的亚细胞定位

图1 为AtGST8基因的亚细胞定位，从中可以看出细胞膜中有明显的荧光信号，细胞核中也有少量信号，这表明AtGST8基因至少定位于细胞膜。

图1 AtGST8 基因的亚细胞定位Fig. 1 Subcellular location of AtGST8 gene

2.2 AtGST8 基因在组织中的表达

2.2.1 GUS 组织表达分析

选取AtGST8pro:GUS 的转基因植株T2 代进行GUS 染色，分析AtGST8在组织中的表达情况（图2）。从图中可见，在转AtGST8基因启动子区域的拟南芥的种皮和胚中均没有发现蓝色，表明该基因在上述两个部位均未表达（图2（a）和（b））；在7 日龄的幼苗中可以看到叶片及心叶都被染成了蓝色，表明该基因在此部分表达较强（图2（c））；根部的成熟区尤其根尖蓝色较深，表明该基因表达显著（图2（d）和（e））。另外，在土壤中生长35 d 的拟南芥莲座叶叶肉细胞（图2（f））、茎（图2（g））、柱头和花（图2（h））及果荚（图2（i））中均发现AtGST8表达，且在莲座叶中表达较弱，而在花和果荚中的表达与发育进程相关。在花中的表达随着开放程度增大而减弱，但是在果荚中，果荚越成熟，表达越明显（图2（h）和（i））。

图2 AtGST8pro:GUS 在转基因拟南芥中的表达Fig. 2 The expression patterns of the AtGST8pro:GUS in transgenic Arabidopsis

2.2.2 荧光定量分析AtGST8的表达

选取拟南芥野生型Col-0的叶、茎、花及果荚对不同器官中AtGST8基因进行荧光定量表达分析。从图3（a）中可以看出，AtGST8基因在果荚中表达量最高，叶片中最低。角果、花和茎的表达量分别比叶片增加了180%、100%和30%。同时，对获得的4个过表达株系T2 代AtGST8基因的表达进行了分析，各株系的表达量均显著高于野生型（图3（b））。

图3 茎、叶、花和荚中AtGST8 基因的表达及过表达AtGST8 株系的鉴定Fig. 3 Expression of AtGST8 gene in stems，leaves，flowers and pods and identification of over-expressed AtGST8 lines

2.3 MV 胁迫对过表达AtGST8 植株MDA、和伤害程度的影响

图4 MV 下拟南芥野生型和过表达AtGST8 植株中MDA 和产生速率的变化Fig. 4 Changes of MDA and production rate in wild-type and over-expressed AtGST8 plants of Arabidopsis under MV

图5 MV 下拟南芥野生型和过表达AtGST8 植株幼苗组织的染色变化Fig. 5 Staining changes of wild-type and over-expressed AtGST8 plants in Arabidopsis seedlings under MV

2.4 MV 胁迫对过表达AtGST8 植株抗氧化物质含量的影响

正常生长条件下，野生型Col-0和过表达AtGST8植株中的AsA 含量无显著差异。但MV 处理显著增加了所有材料中的AsA 含量，且野生型Col-0增幅小于过表达AtGST8植株（图6（a））。与未处理相比，MV 处理后野生型Col-0的AsA 含量增加了34.3%，过表达AtGST8植株OE-24、OE-44则分别增加了42.3%和40.0%。与对照相比，MV 处理使野生型Col-0植株中GSH 含量显著下降（图6（b）），GSSG 含量则显著增加（图6（c）），GSH/GSSG 表现与GSH 一致（图6（d））。与对照相比，过表达At-GST8植株经MV 处理后的GSH、GSSG 及GSH/GSSG 差异均不显著（图6（b）—（d））。实验结果表明，MV 胁迫下过表达AtGST8植株中AsA 含量及GSH/GSSG 比较高，有利于体内活性氧的清除，从而保持较为正常的生理功能；而野生型Col-0植株中GSH/GSSG 比显著下降，因而受到伤害较大。

图6 MV 下拟南芥野生型和过表达AtGST8 植株中抗氧化物质含量的变化Fig. 6 Changes of antioxidant content in wild-type and over-expressed AtGST8 plants of Arabidopsis under MV

2.5 MV 胁迫对过表达AtGST8 植株抗氧化保护酶活性的影响

SOD、POD 和CAT 是一类氧化胁迫保护酶，能及时清除体内活性氧，从而保护植株免遭伤害。从图7（a）—（c）中可见，MV 处理后，野生型Col-0和过表达AtGST8植株中相应的POD、SOD 和CAT 活性均比对照显著增加，其中POD 活性在MV 处理后所有材料增幅范围为15.0%～22.3%，SOD 为14.4%～35.2%，CAT 为12.4%～21.4%。过表达AtGST8植株中，除POD 增幅稍低外，SOD 和CAT 活性增幅均高于野生型Col-0，这表明过表达AtGST8植株可能利用更多的SOD 将胁迫产生的活性氧转变成H2O2，再利用CAT 来清除H2O2，从而减轻植株氧化损伤。

图7 MV 下拟南芥野生型和过表达AtGST8植株中保护酶活性的变化Fig. 7 Changes of protective enzyme activity in wild-type and over-expressed AtGST8 plants of Arabidopsis under MV

APX 在抗坏血酸的转变中发挥重要的作用。从图7（d）中可看出，植株经MV 处理后，拟南芥野生型Col-0和过表达AtGST8植株OE-24、OE-44中的APX 活性均显著提高，增加幅度达46.3%～73.3%。GSH-Px 可以在H2O2的作用下将GSH 转变成GSSG，从而减少H2O2的毒害。从图7（e）可看出，正常生长条件和MV 胁迫下，过表达AtGST8植株中GSH-Px活性均稍高于野生型Col-0。MV 胁迫后，GSH-Px 活性野生型Col-0中增加了5%左右；过表达AtGST8植株OE-24、OE-44则分别增加了19.8%和16.6%，增幅明显高于野生型Col-0。表明过表达AtGST8 植株可以通过增加植物体内GSHPx 的活性，催化GSH 与H2O2作用，起到保护细胞膜结构和功能完整性的作用。

由图7（f）可以看出，正常生长条件和MV 胁迫下，过表达AtGST8植株中的GST 活性均高于野生型Col-0。经MV 处理后，与对照相比，过表达AtGST8植株OE-24、OE-44中GST 活性分别增加了16.2%和50.5%，处理前后GST 活性差异呈显著水平。而野生型Col-0中的GST 活性仅增加了4.5%，与对照相比差异不显著。

2.6 MV 胁迫对过表达AtGST8 植株活性氧保护酶相关基因表达的影响

对参与活性氧清除保护酶的相关基因表达进行了分析（图8）。与对照相比，MV 处理均使野生型Col-0中POD 基因PRX34、CAT 基因CAT1和APX基因SAPX表达明显上调，而GST8的表达量则无明显变化；过表达AtGST8植株OE-24和OE-44中的PRX34、CAT1、SAPX和GST8的表达量均上调，且达到显著水平。表明在MV 处理下，可导致PRX34、CAT1、SAPX和GST8的上调，进而促进了保护酶活性的增加。

图8 MV 下拟南芥野生型和过表达AtGST8 植株中保护酶相关基因表达的变化Fig. 8 Changes of protective enzyme relative gene in wild-type and over-expressed AtGST8 plants of Arabidopsis under MV

3 讨论

在植物中，多种胁迫可诱导GST 表达来减轻氧化损伤对植物的伤害，从而增强植物的抗性[31]。如高温、外源H2O2、HgCl2、水杨酸和百草枯条件下会使组织中GST上调表达[32]，本研究中拟南芥野生型Col-0经MV 处理后GST表达没有显著变化，但过表达AtGST8植株却显著增加（图8（d）），推测其可能是造成过表达AtGST8植株受伤害较小、野生型Col-0伤害较大的主要原因（图4 和图5）。也有研究表明，外界条件造成GST 的变化可能与GSTs 的种类有关，如在大豆和玉米中观察到双氯胺和乙醇处理诱导tau 类GST 的表达量上调，但对phi 类GST 的影响却相反[13]。本研究中也发现MV 处理对AtGST8（GSTU19）表达量的影响与tau 类GST 一致（图8（d））。此外，使用物质的种类及浓度对GSTs表达的影响也有差异。与phi 的GSTF7和GSTF8相比，在水杨酸处理下，拟南芥中tau 类GSTU19和GSTU7更容易被诱导表达，且在低浓度（0.1 mmol/L）下效应更显著，而phi 类GSTF在高浓度（1 mmol/L）下表达量会高些[7]。在MV 处理下，低浓度（0.01～0.03 mmol/L）下过表达棉花GST的转基因烟草中其表达量增加，但在高浓度0.05 mmol/L 时增加更明显[33]。本研究中采用20 μmol/L 的MV 处理则是显著增加了AtGST8的表达（图8（d））。表明处理物质的种类及浓度也是影响植物中GST 的重要原因。

有多个研究结果表明，过表达GST基因能够提高植物的抗逆性，如柽柳中过表达基因GSTZ1可明显提高转基因拟南芥对盐和干旱的耐受性[34]。与生长素结合蛋白基因Atpm24编码序列相同的GST基因过表达明显增强拟南芥对紫外辐射损伤作用的耐性[35]。水稻基因OsGSTl2转入到拟南芥后，植株能表现对重金属的高耐受性[3]。转基因石竹过表达GST后通过合成螯合素，可将多余的重金属铜离子隔离和解毒，从而提高对铜离子的耐性[36]。也有研究发现，GSTU19过表达通过增加幼苗的存活率、叶片的保水率从而提高拟南芥对盐、干旱胁迫的耐受性，加速了种子萌发过程中子叶的生长，提高了拟南芥对低浓度MV（小于3 μmol/L）胁迫的耐性[11]。AtGSTF8和AtGSTU19突变体在盐胁迫下和H2O2含量增加而提升了其对盐的敏感性[37]。本研究中也构建了过表达载体，发现过表达AtGST8可以减少膜脂过氧化产物MDA 的积累和超氧阴离子的产生（图4 和图5），提高了拟南芥幼苗对高浓度MV（20 μmol/L）的耐性。

GST含量增加能帮助植物维持体内氧化还原的稳态，从而保护植株免受氧化损伤[31]。植物体内之所以能够维持氧化还原稳态，其重要原因是体内活性氧产生与清除保持平衡。AsA 和GSH 作为重要组成部分，在非酶促系统中参与活性氧清除，有研究发现，野生型幼苗可能主要通过AsA 依赖的途径来完成[38]，另一方面，谷胱甘肽依赖途径导致GSSG积累的增加，可能又会降低AsA 的利用率。还有研究发现，GSH/GSSG 的比值对植物逆境响应有重要影响[39]。本研究中发现所有供试材料经MV 处理后AsA 含量均显著增加，但过表达AtGST8植株增加更显著。MV 处理使野生型GSH 明显下降、GSSG明显上升，导致GSH/GSSG 明显下降，但过表达At-GST8植株则变化不明显（图6），表明较低的GSH/GSSG 及AsA 的增加较少是造成拟南芥野生型Col-0活性氧增加的重要原因。此外，植物在遭到逆境时，可通过抗氧化酶来调节活性氧水平[40]。在本研究中，MV 处理增加了所有植株中的SOD、POD、CAT、APX活性，但过表达AtGST8植株增幅大于野生型Col-0；显著增加了过表达AtGST8植株中GSH-Px 和GST 活性，而野生型Col-0变化不明显（图7）。同时也对保护酶中相关基因的表达水平进行了分析（图8），其变化趋势与保护酶活性一致。表明过表达AtGST8植株SOD 活性较高，能够将MV 胁迫产生的过多活性氧自由基转变成H2O2，利用CAT 进一步清除H2O2，或利用更多的GSH-Px 及GST 催化GSH 与H2O2反应，从而达到降低植株的氧化损伤的目的。

4 结论

利用转基因植株及GUS 染色发现该基因在幼苗、根、花中表达较强，茎和莲座叶中较弱，花和果荚中的表达随着发育进程而变化，花中随着花期进程而下降，果荚中却随着生育进程而不断上升。拟南芥AtGST8至少定位于细胞膜上。荧光定量分析该基因在野生型拟南芥不同器官中表达量，发现果荚中最高，叶片中最低。过表达AtGST8植株下维持较低的MDA 和O2·-与较高的AsA 含量及GSH/GSSG 比、抗氧化保护酶活性（SOD、POD、CAT、APX、GSH-Px 和GST）及转录水平，是植株在MV 胁迫下伤害较轻的重要原因，表明拟南芥过表达AtGST8通过提高活性氧的清除能力从而减轻了MV 胁迫对植株的损伤。