正交设计优化温通凝胶贴膏基质组方及补骨脂素和异补骨脂素含量测定*

陈诗敏，吴雪茹，黄晓冰，袁伟彬

（1.广州中医药大学第三临床医学院，广东 广州 510378；2.广州中医药大学第三附属医院，广东 广州 510378）

温通凝胶贴膏由补骨脂、蛇床子、当归、续断、覆盆子、远志、狗脊、丁香、安息香、辣椒、独活、羌活、干姜共13味中药组成，是我院名老中医刘庆思教授的经验方，并在20世纪90年代初被批准注册为广州中医药大学附属骨伤科医院制剂。温通膏原是凝胶剂[1]，质地相对清稀，主要用法为在患处涂抹，在使用过程中会在皮肤上残留药渣，容易被衣物搽拭带走，导致药物吸收减少，影响疗效。凝胶贴膏主要指将原料药与一定比例的亲水性基质经过充分混合均匀，然后将混和好的基质涂覆于背衬的膏剂材料上而制备成的一种贴膏制剂[2]，有背衬层保护膏体，且膏体软硬适中，不易污染衣物。笔者采用正交试验设计对基质组方进行优化，将其研制成凝胶贴膏，以期在临床使用中发挥更好疗效。同时建立补骨脂素和异补骨脂素的含量测定方法，便于进行质量控制。

1 仪器与材料

1.1 仪器 德国赛多利斯BL600电子天平（深圳市泰立仪器仪表有限公司）；华凌BCD-208GSH冰箱（广州美的华凌冰箱有限公司）；JA1103型电子分析天平（上海凯鸿诚称重设备有限公司）；CZY-G初黏性测试仪（济南新准仪器设备有限公司）；B20万能搅拌机（广东力丰机械制造有限公司）；JST-150滚刀式水凝胶涂布机（泉州市广隆机械设备有限公司）；持黏性测试仪（医院自制）；剥离强度试验机（济南赛成电子科技有限公司）。

1.2 试药 温通凝胶贴膏中药药材[国药集团冯了性（佛山）药材饮片有限公司]；药用级聚丙烯酸钠（NP-700，日本昭和电工株式会社，批号：171370A）；乙二胺四乙酸二钠（EDTANa2，佛山市宇志精细化工产品有限公司，批号：20101115）；甘油（潍坊晨星化工科技生产甘油公司，批号：20220221）；酒石酸（山东尊宏生物科技有限公司，批号：20110615）；甘羟铝（湖北康明德医药化工有限公司，批号：10061061）；高岭土（广州玖泰生物科技有限公司，批号：20211207）；卡波姆（广州齐信药业科技有限公司，批号：C03220220202）；三乙醇胺（德旭新材料(广州)股份有限公司，批号：20211202）；聚山梨酯-80（河北墨星生物科技有限公司，批号：F104C220101）；冰片（福建南平青松化工有限公司，批号：220103）；薄荷脑（黄山天目薄荷药业，批号：211015）；樟脑（湖北美林药业，批号：12103002）；松节油（湖南尔康制药股份有限公司，批号：0006220210901）；月桂氮卓酮（湖北科捷制药有限公司，批号：211102）；补骨脂素对照品（南京道斯夫生物科技有限公司，批号：110739-201617）；异补骨脂素对照品（武汉睿辰标物科技有限公司，批号：110739-201614）；药油、浸膏（根据制剂处方比例制备，见“2.2”）。

2 方法和结果

2.1 正交试验[3]优化制剂基质组方 通过预实验确定处方中甘油、EDTA-Na2和卡波姆的用量。采用L9（34）正交试验法对不同比例的NP-700、高岭土、甘羟铝和中药进行了试验。以不同比例的凝胶贴膏的涂布指标、成型指标，成型凝胶贴膏的初黏力、持黏力、剥离强度作为评价指标，评价不同比例凝胶贴膏的质量。根据各指标的影响水平的差异，将涂布指标和成型指标定为25分、初黏力定为10分、持黏力定为20分、剥离强度定为20分，总分合计100分。经综合评价后，选取得分最高的含药量和最佳的制剂成型配方并进行验证。（见表1）

表1 制剂配方正交设计表

2.2 温通凝胶贴膏的制备 在前期已通过大量研究[3]，确定温通膏方最佳提取工艺为12倍量50%乙醇回流提取3次，每次120 min，提取液浓缩成相对密度为1.2（60 ℃）浸膏，照配方设计的量，称取卡波姆原料18 g，加入一定体积的纯化水使卡波姆膨胀并过夜，而后在卡波姆液体中加入三乙醇胺40 g搅拌，制成凝胶状备用。另外，将NP-700、高岭土、甘羟铝、EDTA-Na2与1 125 g甘油充分混合，搅拌均匀后备用；往前述液体中加入规定量的中药浸膏、药油，并逐步加入聚山梨酯-80 40 g，酒石酸2 g，充分搅拌均匀，最后一步，加入前述制备的卡波姆和三乙醇胺混合凝胶，经充分搅拌形成黏度适中的药料；涂抹，切割成（9 cm×12 cm）/贴；放置48 h固化成型，即得温通凝胶贴膏。

2.3 温通凝胶贴膏的评价指标[4]以成型凝胶贴膏的综合得分（包括涂布指标、成型指标、初黏力、持黏力、剥离强度）作为评价指标，评价不同比例下凝胶贴膏的质量。根据各指标的不同影响程度，确定涂布指标和成型指标分别为25分，初黏力为10分，持黏力为20分，剥离强度为20分，总分合计100分。

2.3.1 涂布指标评价[5]对凝胶贴膏的涂展性、抛锚性、布卷缩（满分10分）、外观完整性（满分5分）、色泽均匀度（满分5分）、涂布速度（满分5分）进行评价。

2.3.2 晾干48 h成型指标[6]对凝胶贴膏外观完整性（满分5分）、色泽均匀度（满分5分）、纸能否掀开（满分5分）、拇指按压残留性（满分5分）、黏弹性（满分5分）进行评价。

2.3.3 初黏力指标评价 参见《中华人民共和国药典》（2020年版）通则0952第一法[4]。测量值由钢球的滚动距离计算，单位为厘米。测量的最小值（初黏力最大）为10分，其余与之相比计算初黏力得分。

2.3.4 持黏力指标评价 参见《中华人民共和国药典》（2020年版）通则0952第二法[4]。它是通过膏体从测试板上脱落的时间及砝码质量计算，单位：时间（min），质量（g）。以测得质量和时间的最大值（持黏力最大）为20分，其余与之相比计算持黏力得分。

2.3.5 剥离强度的测定 参见《中华人民共和国药典》（2020年版）通则0952第三法[4]。它是通过膏体从测试板上脱落的时间及砝码质量计算，单位：时间（min），质量（g）。以测得质量和时间的最大值（剥离强度最大）为20分，其余与之相比计算剥离强度得分。

2.4 实验结果 从9个正交设计的实验成品中获得了不同的综合感官评分、初始黏度评分和剥离强度评分。以每种成品的总得分为指标评估相应的处方比例，并使用正交辅助软件辅助分析。（见表2）

表2 温通凝胶贴膏的评价指标

根据表2中的极差范围，通过视觉分析，各因素对总分的影响为A>D>B>C；为了验证视觉分析的可靠性，对实验数据进行了方差分析。（见表3）

表3 温通凝胶贴膏评价指标的方差分析

综上所述，NP-700（A）、高岭土（B），甘羟铝（C），中药量（D）4个因素最优选工艺是A3B1C1D1，即NP-700∶高岭土∶甘羟铝∶中药量=300∶300∶10∶1 000（质量比）。

2.5 验证实验 通过正交试验优化比例组成，按最优配比制备温通凝胶贴膏剂，称取18 g卡波姆原料，加入一定体积的纯化水，使卡波姆完全溶胀，再加入40 g三乙醇胺搅拌成凝胶状，备用。将NP-700 300 g、高岭土300 g、甘羟铝10 g和EDTA-Na22 g与1 125 g甘油充分混合，搅拌均匀后备用；往前述液料中加入中药浸膏611 g，药油556 g，并逐步加入聚山梨酯-80 40 g，酒石酸2 g，充分搅拌均匀，最后加入前述制备的卡波姆和三乙醇胺混合凝胶，搅拌使其逐步交联；涂布，切割，放置48 h固化成型；制备3批样品。分别测定了温通凝胶贴剂的涂布指标、成型指标、初黏力、持黏力、剥离强度，并计算了总得分。结果表明，根据优化的工艺条件制备的贴剂具有优异的性能和较高的综合得分。（见表4）

2.6 HPLC法测定温通凝胶贴膏中的补骨脂素和异补骨脂素

2.6.1 色谱条件 色谱柱：Inertsil ODS-SP C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.02 mol/L∶磷酸二氢钠溶液（28∶72）；检测波长：246 nm；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：10 μL。

2.6.2 专属性考察 混合对照品溶液的制备：取补骨脂素、异补骨脂素对照品适量，精密称定，甲醇定容，制备成每1 mL溶液含补骨脂素、异补骨脂素各200 μg的混合对照品贮备液，置4 ℃下保存备用。

供试品溶液的制备：取温通凝胶贴膏供试品，除去防黏层，刮取膏体10.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加甲醇40 mL，超声（150 W，40 kHz）提取2次，每次1 h，合并2次提取液，残渣加甲醇洗涤3次，每次10 mL，洗涤液并入提取液，水浴蒸干，残渣加甲醇溶解并定容至10 mL，摇匀，0.45 μL微孔滤膜过滤，即得。按处方制备工艺制备不含补骨脂药材的阴性贴膏，同法制得阴性对照品溶液。

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各10 μL，进样测定，记录色谱图，阴性对照品在对照品色谱峰相应保留时间未出现杂质峰，其他成分对被测成分无明显干扰，色谱专属性好。（见图1）

图1 HPLC 色谱图

2.6.3 线性关系考察 在前期的研究[2]中，已测得补骨脂素线性回归方程为Y=87 764.3X+33 931.9（r=0.999 9），异补骨脂素线性回归方程为Y=80 044.6X+21 533.2（r=0.999 9）。结果表明补骨脂素、异补骨脂素在1.6～56.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.6.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液10 μL，连续进样6次，记录每次峰面积。结果补骨脂素、异补骨脂素色谱峰面积RSD分别为0.937%、0.912%，表明仪器精密度良好。

2.6.5 重复性试验 按照“2.6.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，分别精密吸取10 μL进样测定，记录色谱峰面积。结果补骨脂素、异补骨脂素封面积RSD分别为2.115%、2.032%，表明该方法重复性良好。

2.6.6 稳定性试验 取混合对照品溶液室温下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h精密吸取10 μL进样测定，记录色谱峰面积。结果补骨脂素、异补骨脂素色谱峰面积RSD分别为1.214%、1.342%，表明补骨脂素与异补骨脂素在24 h内稳定。

2.6.7 加样回收率试验 精密量取温通膏方提取液9份，每份2.5 mL，分3组分别加入已知浓度的混合对照品溶液0.8、1.0、1.2 mL，按供试品制备方法同法制备，进样测定，得到补骨脂素、异补骨脂素的平均回收率分别为100.85%、101.33%，RSD分别为2.01%、1.98%。

2.6.8 样品测定 取3个批次温通凝胶贴膏，按“2.6.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，3批供试品补骨脂素、异补骨脂素含量的平均值分别为11.134 μg/g，11.104 μg/g。3批贴膏各项结果的RSD均小于2%，因此，该方法测定温通凝胶贴膏中补骨脂素和异补骨脂素含量稳定性好，重现性佳。

3 讨 论

中药凝胶贴膏作为我院的特色制剂，已研制出一系列适用临床、深受患者欢迎的品种[7-10]。本研究在多年生产经验上进行，优化成型的产品易涂布，外形平整美观，揭贴时既不会有很大的牵拉感使皮肤感到不适，又不会因为黏性不足导致膏体易于脱落。温通膏原为凝胶剂，用于涂抹患处，治疗时间受限制，把剂型开发成凝胶贴膏剂，贴敷时间充足，能最大限度发挥疗效。

本实验以部分被中和的聚丙烯酸钠（NP-700）为骨架材料，和甘羟铝发生反应交联后形成水溶性骨架结构。甘羟铝用量过多会导致膏体内聚力过大[11]，膏体搅动困难，从而导致涂布后布卷缩，甚至无法完成涂布，用量不足则两者之间交联不够，膏体无法形成三维网络架构，或成型时间加长。本研究甘羟铝用量在一个合适范围，所制备的凝胶贴膏黏性好，成型时间适中，易于涂布。高岭土作为填充剂，不与物料组分起不良作用，优选用量能使主药均匀分散，并在一定程度上保持膏体刚性[12]。本实验中药量以比重为1.2的浸膏形式加入，浸膏含有一定水分，流动性强，无法填充贴膏骨架结构，高岭土能使浸膏充分分散，赋予药物刚性，与骨架材料胶合，改善膏剂性能，膏体色泽均匀，光滑细腻。

制剂有良好的成型性和美观的外表可令患者使用舒适。制剂的有效成分含量是其显效的基础，所以有效成分的测定也至关重要，本研究建立的含量测定方法，稳定可行，可用于定量鉴别。

中药凝胶贴膏因具有载药量大、贴敷舒适[13-14]、能反复揭帖、不污染衣物等独特优势备受关注，本研究使用的所有基质辅料均在常温下可溶解混合，制备工序适合工业化生产，所建立的含量测定方法专属性好，可为以后更好应用于临床打下一定基础。