单纯疱疹病毒Ⅰ型在三叉神经节潜伏复发机制的研究进展

董亚慧,赵 格,周庆军

0 引言

单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus type Ⅰ, HSV-1)感染所致的单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是一种全球性的严重致盲性眼病。HSV-1在角膜初发感染后被转运至三叉神经节(trigeminal ganglion,TG)进入潜伏状态,在宿主免疫能力下降等因素的影响下,潜伏的HSV-1会再次活化,并转运至原发感染部位,引起HSK的复发[1],临床主要表现为角膜知觉减退、新生血管和瘢痕化,最终需行角膜移植复明。根据统计,虽然92%的正常人泪液中可以检测到HSV-1的DNA[2],但只有28%～32%的患者会出现复发的症状[3],在我国人群中HSK的患病率为11/10000[4]。同时,HSV-1初发感染症状较轻,甚至无明显症状,临床上最常见的是复发性HSK。因此,阐明HSV-1在三叉神经节内潜伏复发的分子机制对于HSK的临床防治十分重要。

1 HSV-1感染潜伏的基本过程

HSV-1是一种典型的嗜神经病毒。目前的研究发现:角膜上皮细胞表达一系列介导HSV-1感染的蛋白,如Nectin 1,HVEM(herpes virus entry mediator),PILR-α(paired immunoglobulin-like type 2 receptor-alpha)[5-6],病毒感染后在角膜上皮细胞内完成其复制组装过程,而后扩散至角膜上皮层中的三叉神经节末梢,并沿三叉神经节轴突反向转运至神经元胞体,在胞体中病毒基因组整合到宿主细胞核中,并通过宿主的调控机制转录,最终导致大量复制或者建立潜伏。研究表明,通过神经元轴突逆行转运感染胞体的途径容易建立潜伏,而直接感染胞体或树突则更易导致病毒的大量复制[7-8]。HSK初发感染后潜伏的建立,是由病毒自身的调控以及神经元胞体的特殊结构所导致的宿主反应共同影响的[1]。在三叉神经节细胞中,病毒裂解相关的基因表达受到明显抑制,其部分DNA序列整合到宿主细胞基因组中,只表达潜伏相关转录体(latency-associated transcripts,LAT),最终完成HSV-1在三叉神经节细胞中的潜伏。

2 HSV-1在三叉神经节潜伏的调控机制

虽然早在1973年即已证实HSV-1在角膜感染后转运至三叉神经节内潜伏[9],但又经过10余年的探索,研究者才逐渐发现HSV-1病毒自身和宿主反应都参与并维持着其在三叉神经节内潜伏的调控。

2.1 病毒的调控

2.1.1 抑制病毒增殖性基因的表达人受HSV原发感染后,HSV常在感觉神经节中终身潜伏,有时也能在迷走神经、肾上腺组织和脑中检出。病毒的DNA以游离环状附加体(episome)形式存在。潜伏状态下只有很少的病毒基因表达。研究表明,病毒进入神经元的位置可影响病毒增殖性基因的表达,从而对感染结果有相当大的影响[7]。一些病毒相关的调节因子,例如病毒的细胞溶解启动蛋白VP16,在轴突中的运输相当低效,这样就能通过抑制增殖性基因的高效表达来促进潜伏。实验发现,轴突途径感染所导致的潜伏,可被胞体途径的二次感染破坏,二次感染的病原体使用的是可释放VP16的病毒或是具有类似刺激作用的复合物。VP16蛋白的缺乏可降低几种早期毒力基因(immediate-early gene)的表达,其中包括ICP0——一种重要的病毒基因表达调控因子,可拮抗宿主的抑制因子,且在潜伏模型的复发中也起到重要作用[10]。以上结果强调了神经元在结构上的独特性质,并警示我们包括HSV-1在内的神经元营养性病毒可以利用这种特性作为自己的感染优势。

2.1.2 潜伏相关的miRNA miRNA是近代生物医学研究中最重要的发现,它可为宿主基因提供一种特殊水平的转录后调控。多数疱疹病毒在潜伏期间可以产生一定数量的miRNA,进而可以影响病毒和宿主细胞的基因表达。宿主中同样有miRNA,病毒感染可对其表达产生重要影响[11]。目前主要的研究发现,HSV-1的LAT与其在三叉神经节内潜伏的建立和维持密切相关。LAT类似于哺乳动物细胞中稳定的长链非编码RNA(lncRNA),是一种miRNA前体,可编码产生几种不同的miRNA(包括miR-H2-3p、miR-H6、miR-I等),从而可以在宿主细胞中抑制几种关键的毒力因子ICP0、ICP4和ICP34.5的表达[11-13]。LAT在潜伏期的TG内大量转录,主要通过下调病毒增殖性基因的表达和抵抗宿主神经元凋亡两种机制维持HSV-1在TG内的潜伏[14]。与LAT相关的miRNA(如miR-LAT和miR-I)可以通过影响TGF-β信号通路介导的抗凋亡功能,控制HSV-1毒力因子ICP34.5表达的开关功能来调控HSV-1在神经细胞中的潜伏和复发[12,15]。

2.1.3 抵抗宿主神经元坏死尽管维持HSV潜伏感染和控制复发频率的病毒基因编码机制依然不甚明确,但已有重要证据显示HSV-1中的LAT有助于维持病毒的长期潜伏,并能保护感染的宿主神经元免于坏死的命运。在小型动物模型中,缺乏LAT基因的突变病毒依然能够复制和建立潜伏,然而却更易复发。小鼠的体内实验表明,在三叉神经节中,LAT可以影响潜伏感染的神经元的绝对数量,但在颈背根神经节中就没有这种影响,说明这与感染途径或神经元类型也有一定关系[16]。神经元特异的miR-138能够通过抑制病毒即早期毒力基因ICP0的表达和促进神经细胞的存活[17]来维持潜伏。

2.1.4 表观遗传调控一些机制与毒力基因沉默相关,其中包括表观遗传调控(甲基化和乙酰化)。研究者用小鼠三叉神经节细胞为感染模型进行染色质免疫沉淀(ChIP)实验,来探究潜伏期HSV-1的游离环状附加体基因组成。结果显示与毒力调节基因相关的组蛋白带有抑制性染色质的典型标记,即组蛋白3的第9位赖氨酸(H3K9me2/3)和第27位赖氨酸(H3K27me3)的二甲基化或三甲基化,还有降低的组蛋白乙酰化程度[18-19]。

2.2 宿主的调控

2.2.1 潜伏的维持在潜伏的建立过程中,HSV-1基因组可能通过宿主DNA的修复机制,被核心组蛋白以规律排列的核小体形式组装起来。包括转录活跃区在内的所有基因组关键区域,都被证明与核小体有关,该结构被认为在HSV-1潜伏过程的基因表达中起重要作用[20]。所有潜伏的疱疹病毒采用相似的排列形式,这也许就是它们不整合基因组却可以长期在细胞中维持的原因[21]。

早在一个世纪之前,人们在治疗三叉神经痛时,发现相应神经的创伤可引发其所支配的皮肤区域的疱疹[22],这最终使人们意识到,感觉神经节是复发病毒的来源之处,且复发极有可能是因为神经失去了营养支持。许多细胞能够分泌神经生长因子(NGF)——一种首次被认可的神经营养因子。NGF可以结合膜相关受体,即由NGF依赖性感觉和交感神经元所表达的酪氨酸激酶TrkA。TrkA受体被NGF激活后产生信号,持续激活的PI3-K/Akt信号通路,对维持HSV-1在神经细胞内的潜伏起关键作用(图1),此通路一方面可通过活化下游具有调节蛋白翻译功能的mTOR(mammalian target of rapamycin)因子来抑制HSV-1即早期毒力因子的表达,另一方面可诱导抗细胞凋亡的功能促进细胞的存活,从而促进并维持HSV-1在神经细胞内潜伏[23-24]。Du等[25-26]利用潜伏感染的小鼠TG器官培养模型证明抗NGF的抗体可以促进HSV-1的活化,地塞米松诱导的凋亡可以加速潜伏的HSV-1的再活化,这些都进一步验证了NGF激活的通路和抗凋亡功能在HSV-1神经细胞内潜伏的重要性。

图1 PI3-K/Akt信号通路对HSV-1神经细胞内潜伏的调控作用示意图[23]。

2.2.2 免疫的调控自体免疫系统在病毒性角膜炎中发挥重要作用,新近发现该系统的表面活性蛋白(SP)A和D在角膜炎中至关重要,SP通过对病毒配体的高度亲和,抑制其黏附宿主细胞,进一步促进吞噬病毒,同时SP调节免疫细胞功能,保持组织在病毒感染早期的非炎症状态,而在病原菌入侵、机体呈应激状态时,SP-A和SP-D又能促进炎症反应,帮助杀灭病原菌[27]。

HSV原发感染后1wk左右,血中出现中和抗体(IgM、IgG、IgA)。严重的原发感染或经常性复发感染,抗体水平有所增高。这些抗体不能阻止重复感染或潜伏病毒的复发,但可以减轻疾病的严重程度。目前研究发现,宿主免疫相关因子、miRNA以及细胞存活相关信号通路参与调控了HSV-1在宿主体内的潜伏,T细胞对维持HSV-1潜伏状态、抑制复发起关键作用。当机体受到多种因素如紫外照射(太阳暴晒)、压力等刺激下的应激反应、性激素改变、免疫抑制剂的应用、糖皮质激素、角膜移植创伤等[28-33],潜伏的病毒被激活,病毒沿感觉神经纤维轴索下行至神经末梢,感染上皮细胞。上述条件同样可以导致机体免疫失调,产生复杂的免疫反应,多项动物实验研究表明,应激状态会减少驻三叉神经节CD8+T细胞和记忆细胞毒性T淋巴细胞(CTLm)产生,并促进生成IL-6等促炎细胞因子,导致HSV-1从潜伏期重新激活[34]。潜伏感染的神经元也可以刺激免疫系统产生病毒特异性的CD8+T细胞,对三叉神经节中的CD8+T细胞进行处理,使其功能增强或数量增加,可抑制复发[35]。而最新研究表明,反复激活HSV-1可诱导局部HSV特异性CD8+T细胞的衰竭,而阻断有症状患者宿主细胞的衰竭通路可恢复CD8+T细胞的保护作用从而减少复发[36],特定的病毒抗原决定簇的表达会产生具有免疫优势的CD8+T细胞群[37],这些成果为HSK的免疫靶向治疗提供了新方向。

3 存在的问题

3.1 潜伏的基因组是否都可被重新激活大多数潜伏感染的神经元都包含多种游离环状附加体,但不能确定是否这些附加体拥有一致的染色质结构,也不明确它们是否有相同的复发能力。有关感染的进一步研究显示,只有有限数量的整合基因组可以在单个细胞中成功复制,但引起这种限制的原因尚未可知[38]。

3.2 防治手段缺乏目前,针对HSV的不同治疗方式正在逐渐更新,局部和全身治疗都有其特定的治疗模式,有时联合疗法也可以提高其治疗效果[39]。还寄希望于疫苗,特别是新型疫苗,如亚单位疫苗、重组活疫苗、DNA疫苗的研究。在对动物模型进行紫外照射复发前,用毒力减弱的HSV-1病毒作为疫苗产生免疫反应,角膜发病程度减轻,小鼠体内抗HSV抗体增多[40]。在抗HSV的药物中,临床常用的有无环鸟苷(acyclovir)、丙氧鸟苷(ganciclovir)、阿糖腺苷(vidarabine)等。这些药物均能抑制病毒DNA合成,使病毒在细胞内不能复制,从而减轻临床症状,但不能彻底防止潜伏感染的再发。随着研究的不断深入,人们对病毒的潜伏复发机制了解的愈加透彻,Pegg等[41]深入研究了嗜神经病毒的神经侵袭机制,并证明这些嗜神经病毒可以将首轮感染的上皮细胞中的驱动蛋白同化为一种必需的前病毒结构组件,继而继续感染神经元细胞,这一原理可能同样存在于其他病毒系列的感染机制,还有近年来对疱疹病毒从潜伏期重新激活后从感觉神经元到上皮组织的顺行转运能力的研究也在不断完善[42],这些成果都为抗击病毒复发提供了新思路。

4 小结

反复发生的角膜炎症反应可导致角膜敏感度降低、瘢痕形成甚至失明,但类似的症状并不能作为诊断复发性HSK的确凿证据。HSK患者在发现初发感染症状时,应及早请医生确诊,积极治疗。目前,HSK主要依据裂隙灯检查中的临床表现来诊断,但文献中并没有确切的诊断标准。其他检查如聚合酶链式反应测定、酶联免疫吸附测定,免疫荧光抗体和病毒培养可提供更明确的诊断,但也有一定的局限性。目前的治疗方式仅能在减少角膜损伤和控制病毒扩散两方面展开,尚未有治愈措施[43]。