姜黄素对人翼状胬肉成纤维细胞增殖和凋亡及迁移的影响

曹 莉,袁 雪,张飞娥,钱金梅,张小玲,蔡 岩

0 引言

翼状胬肉是一种常见的眼表疾病,世界范围内发病率为1.3%～53%[1]。手术是治疗翼状胬肉的主要方式,但翼状胬肉术后复发率高。有研究表明翼状胬肉的发生发展与翼状胬肉细胞的增殖、凋亡和迁移有关[2]。临床上通过术中使用丝裂霉素等抗代谢药物降低翼状胬肉的术后复发率,但这些药物可能会引起巩膜溶解等一系列严重并发症[3]。因此,需要寻找更加安全有效的药物来治疗翼状胬肉和降低翼状胬肉术后复发率。姜黄素(curcumin,Cur)是从姜黄等植物的根茎中提取得到的疏水性多酚化合物,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化等作用,而无明显毒副作用[4-7]。故本研究用姜黄素对人翼状胬肉成纤维(human pterygium fibroblasts,HPF)细胞进行干预,观察姜黄素对HPF细胞增殖、凋亡和迁移的影响,以及对Bcl-2相关X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein,Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、细胞周期蛋白D1(Cyclin D1,CCND1)、基质金属蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2,MMP2)的mRNA与蛋白表达的影响,以期为翼状胬肉的治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 取材收集新疆军区总医院全军眼科中心在2021-11-24/12-16手术切除的翼状胬肉组织7例。纳入标准:(1)按照诊断标准确诊的位于鼻侧的原发性翼状胬肉;(2)头部平坦,体部菲薄,无明显充血的静止期翼状胬肉;(3)头部侵入角膜2～4mm。排除标准:(1)复发性翼状胬肉;(2)活动性眼部炎症;(3)假性翼状胬肉;(4)单眼多发的翼状胬肉[8]。本研究遵守《赫尔辛基宣言》,通过新疆军区总医院伦理委员会审批(No.20210301007)。所有患者知情并签署知情同意书。

1.1.2 主要试剂与仪器姜黄素(美国Sigma公司)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(美国Gibco公司)、DMEM/F12(1∶1)液体培养基(美国HyClone公司)、二甲基亚砜(美国Sigma公司)、CCK8试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)、动物组织总RNA提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)、兔抗人Vimentin抗体(ab92547, 美国Abcam公司)、兔抗人Pan Cytokeratin抗体(ab234297,美国Abcam公司)、兔抗人Bax抗体(ab182733,美国Abcam公司)、兔抗人Bcl-2抗体(ab182858,美国Abcam公司)、兔抗人Cyclin D1抗体(ab134175,美国Abcam公司)、兔抗人MMP2抗体(ab92536,美国Abcam公司)、兔抗人β-Actin抗体(bs-0061R,北京博奥森生物技术有限公司)、Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG二抗(ab150073,美国Abcam公司)、HRP标记羊抗兔IgG二抗(bs-40295G-HRP,北京博奥森生物技术有限公司)、Transwell小室(美国Corning公司)、酶标仪(美国Thermo公司)、流式细胞仪(美国BD公司)、实时荧光定量PCR仪(美国Thermo公司)、电泳仪及电转仪(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1HPF细胞的体外培养将手术切除的翼状胬肉头、体、颈部组织保存于含100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution,PBS)中,在超净工作台上用PBS冲洗翼状胬肉组织3次,将翼状胬肉剪成约1mm×1mm×1mm大小的组织块,将剪碎的组织块平铺于细胞培养皿,等待30min,待组织块贴壁后向培养皿中加入含100U/mL青霉素、100mg/L链霉素及10%FBS的DMEM/F12完全培养基,将培养皿放置于37℃,5%CO2细胞培养箱中,每2～3d换液一次,待细胞密度生长到80%～90%时采用0.25%胰蛋白酶消化传代,取3～6代细胞用于后续实验。

1.2.2 细胞鉴定将HPF细胞接种于激光共聚焦培养皿中,待细胞密度生长到80%后吸除培养基,PBS浸洗,4%多聚甲醛室温固定细胞15min。PBS浸洗,0.5%曲拉通X-100室温通透细胞30min。PBS浸洗,5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室温封闭1h。弃封闭液,分别加入5%BSA、用5%BSA稀释的兔抗人Vimentin抗体(1∶250)、用5%BSA稀释的兔抗人Pan Cytokeratin抗体(1∶250),4℃孵育过夜。PBS浸洗,加入用5%BSA稀释的Alexa Fluor 488标记驴抗兔IgG二抗(1∶200),室温避光孵育1h。PBS浸洗,加入DAPI避光孵育10min。PBS浸洗,使用荧光显微镜观察发射波长为488nm时蛋白的表达情况。

1.2.3CCK8法检测HPF细胞增殖情况及细胞分组使用二甲基亚砜将姜黄素粉剂配制成100mmol/L的浓储液储存于-20℃,使用时用完全培养基稀释成相应浓度,并且各个浓度的姜黄素中均含有等量的二甲基亚砜。将HPF细胞以5×103个/孔的密度接种于96孔板,设置3个复孔。HPF细胞贴壁过夜后吸除培养基,向培养孔中加入分别含0、10、20、40、80、160μmol/L姜黄素的完全培养基100μL。姜黄素处理HPF细胞24h后吸除培养基并用PBS清洗细胞1次,向培养孔中加入10μL CCK8反应液与90μL DMEM/F12培养基,于37℃,5%CO2孵箱中孵育1.5h后使用酶标仪测量各孔在450nm处的吸光度。计算细胞活力,并使用GraphPad 7.0软件筛选出细胞活力为50%的姜黄素浓度,即半数抑制浓度。以细胞活力为50%左右的姜黄素浓度为高浓度处理组(40μmol/L姜黄素组),浓度递减50%为低浓度处理组(20μmol/L姜黄素组),同时设对照组(不含姜黄素),每组用相应浓度姜黄素处理HPF细胞24h。

1.2.4 流式细胞仪检测HPF细胞凋亡情况各组HPF细胞经相应浓度姜黄素处理24h后收集细胞,用500μL 1×Binding Buffer重悬细胞,加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI,避光孵育15min后用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.2.5Transwell迁移实验检测HPF细胞迁移情况将HPF细胞以1×105个/孔的密度接种于Transwell小室的上室,并在上室中加入相应浓度的姜黄素(用无血清培养基配制)200μL,在下室中加入含20%FBS的完全培养基600μL。将Transwell小室放置于37℃,5%CO2细胞培养箱中,24h后取出Transwell小室的上室。PBS洗涤3次,4%多聚甲醛固定细胞20min,PBS洗涤3次,0.1%结晶紫染色20min,PBS洗涤3次,用棉签擦去上室中未迁移的细胞,PBS洗涤3次,晾干后在显微镜下观察迁移细胞并随机选取5个视野计数。

1.2.6 实时荧光定量PCR检测各组HPF细胞Bax、Bcl-2、CyclinD1及MMP2mRNA表达各组HPF细胞经相应浓度姜黄素处理24h后按照动物组织总RNA提取试剂盒说明书提取细胞总RNA,按照Takara反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA,按照Takara荧光定量试剂盒说明书进行实时荧光定量PCR反应。使用2-△△Ct法计算目标基因的相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.7Westernblot法检测各组HPF细胞Bax、Bcl-2、CyclinD1及MMP2的蛋白表达各组HPF细胞经相应浓度姜黄素处理24h后用PBS浸洗3次。弃PBS后用RIPA裂解液冰上裂解细胞30min,4℃ 12000r/min离心15min后收集上清液。以BCA法对蛋白定量,上清液中加入适量体积的PBS和蛋白上样缓冲液使得最终蛋白浓度为2μg/μL,100℃蛋白变性10min后于-80℃保存。行12% SDS-PAGE电泳,上样量为20μL,80V电泳30min后改为100V继续电泳1h。采用湿转的方式(100mA,1h)将蛋白电转到PVDF膜上。TBST洗膜3次,5%脱脂牛奶封闭2h。TBST洗膜3次,分别加入用抗体稀释液稀释的兔抗人Bax抗体(1∶1000)、兔抗人Bcl-2抗体(1∶1000)、兔抗人Cyclin D1抗体(1∶1000)、兔抗人MMP2抗体(1∶1000)、兔抗人β-Actin抗体(1∶5000),4℃孵育过夜。TBST洗膜3次,加入用抗体稀释液稀释的HRP标记羊抗兔IgG二抗(1∶5000)室温孵育2h。TBST洗膜3次,滴加ECL后进行显色。使用Image J计算各个条带的灰度值。

统计学分析:采用SPSS24.0对数据进行统计学分析,计量资料符合正态分布者采用均数±标准差表示。组间比较采用单因素方差分析;方差齐时,组间两两比较使用LSD-t法;方差不齐时,组间两两比较使用Tamhanr’s T2法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1HPF细胞的培养与鉴定组织块培养第3～5d开始出现少量长梭形细胞从组织块边缘爬出(图1A)。传代至第3代后,细胞为形态均一的长梭形(图1B)。免疫荧光染色显示细胞波形蛋白表达阳性(图1C),广谱细胞角蛋白表达阴性(图1D)。结合标本组织来源、细胞形态学观察及免疫荧光染色结果,可证明本研究培养的细胞为HPF细胞。

图1 HPF细胞的培养及鉴定 A:组织块法培养的HPF细胞;B:第3代HPF细胞;C:HPF细胞波形蛋白表达阳性;D:HPF细胞广谱细胞角蛋白表达阴性。

2.2 姜黄素对HPF细胞增殖的影响与对照组相比,浓度为10、20、40、80、160μmol/L的姜黄素均能抑制HPF细胞的增殖,差异有统计学意义(P<0.05),见图2。并且HPF细胞活力随姜黄素浓度的增加逐渐降低。40μmol/L姜黄素处理24h后HPF细胞活力为54.18%±3.71%,该浓度接近姜黄素的半数抑制浓度(46.38μmol/L),故将高浓度组设为40μmol/L姜黄素组,低浓度组设为20μmol/L姜黄素组,同时设对照组(不含姜黄素)。

图2 姜黄素对HPF细胞增殖的影响(n=3) aP<0.05 vs 对照组;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黄素组。

2.3 三组HPF细胞凋亡情况比较对照组凋亡率为9.18%±0.77%,20μmol/L姜黄素组凋亡率为11.37%±0.87%,40μmol/L姜黄素组凋亡率为31.73%±0.68%,三组间比较差异有统计学意义(F=771.77,P<0.05),20μmol/L和40μmol/L姜黄素组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),40μmol/L姜黄素组与20μmol/L姜黄素组比较差异有统计学意义(P<0.05),见图3。

图3 三组HPF细胞凋亡情况比较(n=3) A:对照组;B:20μmol/L姜黄素组;C:40μmol/L姜黄素组;D:柱状图;aP<0.05 vs 对照组;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黄素组。

2.4 三组HPF细胞迁移情况比较对照组迁移细胞数为88.80±2.46个,20μmol/L姜黄素组迁移细胞数为70.00±2.91个,40μmol/L姜黄素组迁移细胞数为43.67±8.03个,三组间比较差异有统计学意义(F=58.58,P<0.05),20μmol/L和40μmol/L姜黄素组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05),40μmol/L姜黄素组与20 μmol/L姜黄素组比较差异有统计学意义(P<0.05),见图4。

图4 三组HPF细胞迁移情况比较(n=3) A:对照组;B:20μmol/L姜黄素组;C:40μmol/L姜黄素组;D:柱状图;aP<0.05 vs 对照组;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黄素组。

2.5 三组HPF细胞Bax、Bcl-2、CyclinD1、MMP2mRNA表达比较三组间促凋亡基因Bax、抗凋亡基因Bcl-2、增殖调控相关基因Cyclin D1、迁移相关基因MMP2的mRNA表达比较差异均有统计学意义(P<0.05)。20μmol/L姜黄素组Bcl-2的mRNA表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05),与对照组比较,20μmol/L姜黄素组能上调Bax、下调Cyclin D1、MMP2 mRNA表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,40μmol/L姜黄素组能上调Bax、下调Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 mRNA表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。40μmol/L与20μmol/L姜黄素组Bcl-2和Cyclin D1的mRNA表达比较差异均无统计学意义(P>0.05),与20μmol/L姜黄素组相比40μmol/L姜黄素组能下调MMP2和上调Bax mRNA表达,差异均有统计学意义(P<0.05),见表2,图5。

图5 三组HPF细胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 mRNA表达比较(n=3) aP<0.05 vs 对照组;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黄素组。

表2 三组HPF细胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 mRNA表达比较

2.6 三组HPF细胞Bax、Bcl-2、CyclinD1、MMP2蛋白表达比较三组间Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2的蛋白表达水平差异均有统计学意义(P<0.05)。20μmol/L姜黄素组Bax、Cyclin D1及MMP2的蛋白表达与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05),20μmol/L姜黄素组与对照组比较能下调Bcl-2蛋白表达,差异有统计学意义(P<0.05)。40μmol/L姜黄素组与对照组比较能下调Bcl-2、Cyclin D1及MMP2的蛋白表达,上调Bax的蛋白表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。40μmol/L与20μmol/L姜黄素组Cyclin D1及MMP2的蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与20μmol/L姜黄素组相比,40μmol/L姜黄素组能下调Bcl-2的蛋白表达水平,上调Bax的蛋白表达水平,差异均有统计学意义(P<0.05),见表3,图6。

表3 三组HPF细胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2蛋白表达比较

图6 三组HPF细胞Bax、Bcl-2、Cyclin D1、MMP2 蛋白表达比较(n=3) A:Western blot结果;B:柱状图;aP<0.05 vs 对照组;cP<0.05 vs 20μmol/L姜黄素组。

3 讨论

翼状胬肉是一种以局部球结膜纤维血管组织增生并侵犯角膜为特点的常见眼表疾病,可引起视力下降、进行性散光、眼表不适等症状[9]。紫外线照射、抑癌基因失活、上皮—间质细胞转化等是目前公认的翼状胬肉发病的原因,但各因素的具体作用机制有待进一步研究[10]。尽管学者们提出了翼状胬肉切除+自体结膜瓣移植术、翼状胬肉切除+结膜瓣转位术、翼状胬肉切除+自体角膜缘干细胞移植术、翼状胬肉切除+羊膜移植术等新型手术方式,翼状胬肉术后复发率仍高[11]。传统中药姜黄最早记载于《新修本草》,有破血行气,通经止痛的功效[12]。姜黄素作为中药姜黄发挥药理作用的主要活性成分,因其良好的抗肿瘤、抗纤维化等作用而无明显毒副作用受到广泛关注[6-7]。现有的研究表明姜黄素能诱导前列腺癌成纤维细胞的G2/M期阻滞和细胞凋亡,能抑制心脏成纤维细胞的增殖、迁移和胶原生成,能降低TGF-β1诱导的眼眶成纤维细胞分化并减弱眼眶成纤维细胞的促血管生成活性[13-15]。本研究发现姜黄素能抑制HPF细胞的增殖和迁移,并诱导其凋亡,提示姜黄素可能通过抑制HPF细胞增殖与迁移,及诱导HPF细胞凋亡来阻碍翼状胬肉的发展。

姜黄素能通过抑制细胞增殖来抑制肺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生发展[16]。翼状胬肉与具有恶性增殖能力的肿瘤有着某些相同的特性。与边芳等[17]的研究结果相似,本研究也发现姜黄素能抑制HPF细胞的增殖。Cyclin D1可以通过正向调控细胞周期进程来促进癌细胞增殖,而Sare等[18]研究表明姜黄素能通过下调Cyclin D1的表达来抑制肝癌细胞的增殖。与此类似,本研究证实姜黄素能抑制HPF细胞的增殖,并能下调Cyclin D1的表达水平。

细胞凋亡是由基因控制的细胞程序化死亡,抗凋亡基因Bcl-2的下调和促凋亡基因Bax的上调可以诱导细胞的凋亡。姜黄素能上调人永生化角质形成细胞Bax/Bcl-2的比率,并能通过caspase依赖途径和非caspase依赖途径诱导人永生化角质形成细胞的凋亡[19]。本研究发现姜黄素能诱导HPF细胞的凋亡,还能下调Bcl-2的表达水平及上调Bax的表达水平。

与肿瘤有向邻近组织侵犯的倾向相似,翼状胬肉有自结膜逐渐向角膜中央侵犯的倾向。MMP2可通过降解Ⅳ型胶原蛋白使基底膜形成缺损进而促进细胞的迁移[20]。翼状胬肉组织和翼状胬肉成纤维细胞中MMP2和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP9)的表达高于正常结膜组[21]。紫外线照射可以增强HPF细胞的移行能力,而姜黄素可以抑制紫外线照射后翼状胬肉上皮细胞中MMP2和MMP9的表达[22-23]。本研究结果表明姜黄素能抑制HPF细胞的迁移,还能下调其MMP2的表达水平。

综上,本研究发现姜黄素可通过抑制Cyclin D1的表达来抑制HPF细胞的增殖,通过下调Bcl-2并上调Bax的表达来诱导HPF细胞的凋亡,通过下调MMP2的表达来抑制HPF细胞的迁移,这为姜黄素成为一种临床治疗翼状胬肉的药物提供了一定理论依据。