脆弱拟杆菌ATCC25285通过TGF-β/Smad3通路诱导Treg细胞分化缓解结肠炎

魏 芳，范梦慧，刘光臣，顾馨月，邢莹莹

（中国药科大学生命科学与技术学院，南京 211198）

肠道菌群与肠黏膜免疫密切相关，肠道菌群失调常导致炎症性疾病，如溃疡性结肠炎、克罗恩病等炎症性肠病［1-2］。本课题组之前的研究发现，乳酸乳球菌（L.lactis）的肽聚糖可以改变小鼠肠道菌群的多样性，其中最显著的是增加小鼠肠道菌群中拟杆菌门的相对丰度［3-4］。此外，拟杆菌门最常见的成员之一是脆弱拟杆菌（B.fragilis），B.fragilis常见于人体肠道菌群中，也存在于口腔和上呼吸道中。B.fragilis的非产肠毒素菌株被认为是有益细菌，是肠道菌群的重要组成部分，有利于维持肠道稳态［5］。

微生物群落、其代谢物和成分不仅是免疫稳态所必需的，还会影响宿主对各种免疫介导的疾病和紊乱的易感性。短链脂肪酸（SCFAs）是链长1 ～ 6 个碳原子的饱和脂肪酸，是肠道中膳食纤维发酵的主要产物，可以重塑肠道生态，诱导免疫调节和发挥抗菌作用。此外，SCFAs可以调节肠道炎症过程中的炎症信号通路［6］。SCFAs 在肠道炎症免疫调节中的作用，特别是通过G 蛋白偶联受体（GPR）/Toll 样受体（TLR）介导的潜在信号级联反应，已成为现代新兴的热点问题［7-8］。

B.fragilis已被证明可以促进结肠炎中的肠道CD4+T 细胞的扩增并分泌IL-10，从而增加和增强肠道调节免疫力并减轻肠道炎症［9］。此外，通过TLR4 信号通路，B.fragilis可以抑制无菌结肠炎相关结肠癌中肠道炎症和肿瘤的发展［10］。然而，B.fragilis对Treg 细胞作用的特定机制以及它是否可以通过其他免疫途径调节肠道炎症仍然未知。因此，本研究的目的是更进一步地探究B. fragilis在肠道炎症中的免疫调节作用和机制。

在某些条件下，CD4+T 细胞可以被诱导发育成不同的T 细胞亚群，包括效应T 细胞Th1，Th2，Th17 和Treg。研究发现，产生抗炎细胞因子IL-10的Treg 细胞在维持肠道稳态中起着关键作用［11］。但目前尚不清楚B.fragilis如何在肠道炎症的背景下调节Treg细胞的产生。在以前的研究中，TGF-β已被证明会影响Treg 细胞的表达［12-13］。在正常分化的肠细胞中，TGF-β家族成员的各种梯度在维持肠道稳态中起重要作用［14-15］。腔内细菌、细胞因子和其他刺激物均会促进TGF-β 的产生［16-17］。TGFβ 与免疫细胞（T 细胞、B 细胞、DC 和巨噬细胞）和上皮细胞上的TGF-β 受体结合可以诱导细胞内转导途径和肠道稳态的激活［18］。肠道TGF-β 调节多种反应，例如Treg 和Th17 诱导、IEL 发育、IgA 产生、黏附分子表达的调节、预防杯状细胞耗竭和营养不良、抑制IL-10 和IL-33 的产生，以及增强上皮密封性连接表达［19］。在Treg 分化过程中，TGF-β/Smad3 信号通路是决定Foxp3 表达的关键信号转导途径［20-21］，然而B.fragilis是否会影响TGF-β的产生及相关信号的传递尚不清楚，因此，本文将探讨B.fragilis对肠道免疫的调节与TGF-β/Smad3 信号通路的关系。

1 材 料

1.1 试 剂

无菌脱纤维羊血（山西九龙生物科技有限公司）；通用型组织固定液（武汉赛维尔生物科技有限公司）；苏木精、伊红（上海生工生物工程技术服务有限公司）；FastDNA®Spin Kit for Stool（美国MP Biomedicals 公司）；QIA-quick PCR purification kit（德国Qiagen 公司）；胰蛋白胨（英国Oxoid 公司）；大豆蛋白胨（北京奥博星生物技术有限公司）；DSS（美国MP Biomedicals 公司）；琼脂粉（国药集团化学试剂有限公司）；Percoll（美国GE 公司）；胎牛血清1640 细胞培养基（美国Gibco 公司）；Foxp3 固定液/破膜液、APC 抗小鼠Foxp3、抗小鼠ZO-1 抗体（美国eBioscience 公司）；FITC 抗小鼠CD4、Pacific blueTM抗小鼠CD4、PE 抗小鼠CD25、MojoSortTM小鼠CD4 T 细胞分选试剂盒、多因子试剂盒（美国Biolegend公司）；蛋白酶抑制剂（美国APE × BIO 公司）；BCA 定量试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；jetPRIME 转染试剂、siRNA（百奥迈科生物技术有限公司）；Trizol up（美国Invitrogen 公司）；BCA定量试剂盒（北京天根生化科技有限公司）；PAGE凝胶制备试剂盒（上海雅酶生物科技有限公司）；抗小鼠GAPDH 抗体（美国Proteintech 公司）；Phospho-Smad3（Ser423/425）兔单抗（美国Cell Signaling Technology公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪 器

恒温培养箱、冷冻离心机、CO2细胞培养箱（美国Thermo 公司）；分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）；冰冻切片机、荧光倒置显微镜（德国徕卡公司）；BD Calibur/Celesta 流式细胞仪（美国BD公司）；手持式组织匀浆机（德国IKA 公司）；多功能酶标仪（美国Promega 公司）；PCR 仪、实时荧光定量PCR 仪（美国Bio-Rad 公司）；Tanon5200 全自动化学发光图像分析系统（上海天能科技有限公司）。

1.3 动物与菌种

于南京青龙山动物繁育中心购买（20 ± 2） g雌性无特异性病原体（SPF）C57BL/6 小鼠，安置在中国药科大学动物实验中心。所有动物研究均遵循国际医学伦理规范并经中国药科大学动物伦理委员会批准。 脆弱拟杆菌菌种（B. fragilisATCC25285，正文中简写为B.fragilis）购于北京北纳生物技术有限公司。

2 方 法

2.1 实验性急性结肠炎模型

给予小鼠3%葡聚糖硫酸钠（DSS，MPbio）作为饮用水使其自由饮水7 d 以诱导急性结肠炎。然后使用1 × 109CFUB. fragilisATCC25285 灌胃3 d进行治疗。观察并记录粪便的黏稠度、形状以及便血情况，并每天在同一时间记录体重。处死时，测量结肠长度并将距离肛门1 ～ 1.5 cm 处部分结肠置于4%多聚甲醛溶液中进行固定，用于组织病理学分析。

2.2 16S rRNA基因测序

基于Illumina Novaseq 测序平台，对小鼠肠道菌群进行16S rRNA 基因测序，主要过程如下。样品采集：采集小鼠粪便样品并在−80 °C 下保存。DNA 提取：使用该试剂盒从小鼠粪便样品中提取DNA。通过PCR 对靶片段基因进行扩增。产物纯化：纯化试剂盒用于准确定量DNA 的浓度。测序：根据扩增的16S 区特点，构建一个小片段文库，基于Illumina Novaseq 测序平台对文库进行双端测序。从该实验的测序中获得的原始数据已上传到NCBI SRA 数据库。 生物项目编号为PRJNA699675，收录号为SRP305360。

2.3 SCFA定量

通过气相色谱法检测粪便样品中SCFAs 的浓度。取标准液或10%粪便悬浮液500 μL 放入1.5 mL 离心管中，然后加入巴豆酸和偏磷酸混合物（样品与内标比例5∶1）100 μL；均匀旋转，放入−20 ℃过夜；解冻后，以14 000 r/min 离心5 min；取所有上清液，经水相滤膜过滤于新管；向样品瓶中加入滤液100 μL，从试管底部排出气泡，然后进样并检测；标准稀释液：按初始浓度的1/2、1/5、1/10、1/20、1/100 和1/500 稀释比制备标准溶液。然后，使用与上述相同的方法对每个标准样品进行3 次检测。通过比较标准品和样品之间的峰面积来计算样品中SCFAs的浓度。

2.4 组织淋巴细胞提取实验

去除小鼠结肠组织或胃周围的脂肪及结缔组织，取小鼠整段结肠或胃，用眼科剪纵向剪开，除去其内容物并用PBS 洗净；取配制好的组织上皮细胞提取缓冲液14.25 mL 置50 mL 离心管中，加入经热灭活的胎牛血清（5%）750 μL，将组织放入离心管内，250 r/min、37 ℃置于摇床中30 min；取出，经70 μm 细胞筛过滤至一新的离心管中，置于冰上；将剩余组织剪碎，重新加入细胞提取缓冲液14.25 mL 及胎牛血清750 μL，同上条件置于摇床中15 min；溶液经70 μm细胞筛过滤，合并两次所得细胞悬液，1 850 r/min 离心5 min 弃上清液。加入适当比例的70% percoll 溶液，2 350 r/min，加速度为3 N/kg，减速度为0 N/kg，密度梯度离心25 min；依次移去上层及下层溶液（勿吸到中间层），取中间层淋巴细胞；加入适量PBS，1 850 r/min 离心5 min，即得淋巴细胞。

2.5 初始CD4+ T细胞提取实验

取野生型小鼠的脾脏，并在PBS 中用300 目筛轻轻研磨以形成悬浮液，然后过滤。离心后收集细胞沉淀物。CD4+T 细胞通过MojoSortTM小鼠CD4 T 细胞分选试剂盒分离。进行流式细胞术分析，检测CD4+T 细胞的比例，当分选率达到至少90%时进行后续实验。

2.6 Smad3敲减效率验证实验

收取培养48 h 后的转染细胞，用Trizol 试剂提取细胞中的总RNA，将总RNA 1 μg 反转录为cDNA，cDNA 经过QuantStudio3 系统扩增为目的基因片段，以GAPDH 作为内参，采用2-ΔΔCt法计算检测Smad3的表达情况，以此来筛选有效敲低Smad3的siRNA。

2.7 流式细胞术分析实验

通过抗小鼠CD4（GK1.5）和抗小鼠Foxp3 流式抗体（FJK-16s）染色分析Treg的比例和数量。为了分析Th1和Th17细胞的表达，首先在CO2培养箱中用细胞活化混合物（含Brefeldin A）刺激样品过夜，以诱导细胞内细胞因子分泌。用抗小鼠CD4抗体染色后，用细胞内染色缓冲液试剂盒处理细胞，然后用抗小鼠IFN-γ 流式抗体和抗小鼠IL-17流式抗体染色。根据试剂盒说明书操作步骤，使用多因子试剂盒检测结肠IL-10 的表达。所有实验均在多色流式细胞分析仪上进行。

2.8 siRNA敲低实验

针对Smad3 的siRNA 已提前经过脂质体进行修饰，可直接进行尾静脉注射，为确保siRNA 对Smad3 基因的干扰效率，提取小鼠的CD4+T 细胞在体外转染针对Smad3 的siRNA 以筛选出有效序列。通过qPCR 确认敲低效率后，对已给3% DSS饮用水7 d 的结肠炎小鼠尾静脉注射脂质体修饰的siRNA，连续注射3 d。然后如前所述接种B.fragilisATCC25285。

2.9 结肠TGF-β的酶联免疫吸附法实验

称取适量的组织，加入5 倍体积的预冷PBS 溶液（含1% PMSF）。首先，用剪刀将组织切成小块，然后使用手动匀浆仪将组织均质化，直到没有明显的组织碎片（全程放在冰上）；在4 ℃，12 000 r/min下离心15 min，取上清液。使用BCA 蛋白质检测试剂盒对上清液中的蛋白质进行定量，然后根据说明书使用小鼠TGF-β ELISA试剂盒检测TGF-β。

2.10 免疫荧光和苏木精-伊红染色

首先将结肠和胃组织在室温或4 ℃下固定在4%多聚甲醛中过夜。脱水、石蜡包埋和切片后，样品用苏木精和伊红染色。对于免疫荧光分析，用抗小鼠CD4和抗小鼠ZO-1抗体染色样品。所有样品均采用荧光倒置显微镜观察，并采集图像。

2.11 数据统计分析

使用GraphPad Prism 7.0 统计分析各项实验数据和作图，每组数据以均值 ± 标准误差表示，两组独立样本之间采用t检验，多组样本间采用单因素方差分析，以P ＜0.05认为有统计学意义。

3 结 果

3.1 B.fragilis可以改善肠道菌群失衡

为探究B.fragilis对结肠炎小鼠肠道菌群组成和代谢物的影响，本研究首先通过使用3% DSS 水溶液使小鼠自由饮水7 d，构建小鼠急性结肠炎模型。接受正常水的小鼠作为对照组（NC），另一组接受3%DSS 溶液自由饮水。实验结果显示，与NC组相比，DSS 处理的小鼠从第3 天起粪便变稀，便血明显（图1-A）。结肠的长度从正常的8 ～ 9 cm缩短至约6 cm（图1-B）。H&E 染色的结果显示，DSS组小鼠结肠中缺少腺体结构和隐窝，黏膜层中浸润大量炎症细胞（图1-C）。

然后用B.fragilis治疗结肠炎小鼠（如图2-A所示），并对肠道菌群进行16S rRNA基因测序。肠道菌群的α多样性分析，即样品内微生物群落的物种多样性和丰度，表明DSS 诱导的结肠炎小鼠肠道中的微生物群的多样性和丰度降低，在给予B.fragilis后小鼠肠道中的微生物群的多样性和丰度增加，正如图2-C 中物种和Chao 1 指数所反映的。β多样性分析的结果还显示，B.fragilis处理组的多样性显著提高（图2-D）。通过主成分分析（PCA）对测序数据的降维用于监测组间肠道微生物群的结构变化。在主成分处观察到有或没有给予B.fragilis的小鼠肠道微生物群组成的差异，B.fragilis处理的小鼠的簇圈与对照组（NC）的簇圈重叠，表明其肠道菌群与健康小鼠相似（图2-B）。此外，分析了门和属水平上前10 个最丰富的物种，以比较物种的相对丰度及其比例。在门水平上，在结肠炎小鼠中观察到厚壁菌的收缩以及疣状微生物和含有致病菌的变形杆菌的扩张。相比之下，肠道微生物在用B.fragilis治疗的小鼠中表现出恢复正常的趋势（图2-E）。在属水平上，还发现DSS 结肠炎的主要微生物群从厚壁菌、乳杆菌转变为链球菌，而B. fragilis治疗后链球菌显著减少（图2-F）。此外，代谢物的分析表明，使用B. fragilis增加了SCFAs的产生，包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸和异戊酸（图3）。以上实验结果表明，B.fragilis可以有效改善结肠炎引起的肠道菌群失衡，增加SCFAs的产生，从而维持肠道菌群的稳态。

3.2 B. fragilis 通过增加Treg 细胞增强肠道调节免疫力

已知肠道菌群与肠道免疫密切相关，接下来，旨在探讨B. fragilis治疗对肠道免疫的影响，推测结肠炎小鼠的B.fragilis治疗可能会诱导结肠免疫细胞表达和功能的变化。有关报道显示，产生IL-10 的Treg 细胞在维持肠道免疫平衡方面发挥了关键作用。因此，尝试探究B. fragilis如何影响Treg细胞的发展。

首先，B. fragilis处理的小鼠表现出肠道炎症减轻，如体重回升（图4-A）和结肠长度增加（图4-B）。H&E 染色和组织学评分的结果也表明，用B.fragilis治疗的小鼠结肠炎得到有效缓解（图4-C）。更重要的是，使用流式细胞术检测结肠中Treg 的表达，发现Treg 的比例显著增加（图4-D）。同时，IL-10的表达也显著上调（图4-E）。

此外，肠黏膜屏障的功能与肠道免疫密切相关。细胞间紧密连接是肠道屏障中最重要的组成部分，其中紧密连接蛋白ZO-1 起着至关重要的作用。为了评估B.fragilis是否对肠道屏障产生保护作用，通过免疫荧光检测小鼠结肠中ZO-1的表达。正如预期的那样，当结肠炎小鼠使用B. fragilis治疗时，ZO-1表达水平明显升高，表明该治疗可以增强肠黏膜屏障功能（图4-F）。这些发现表明，B.fragilis可以增强肠道调节免疫力并有效缓解肠道炎症。

3.3 B. fragilis 通过TGF-β/Smad3 途径诱导Treg缓解结肠炎

进一步探讨B. fragilis调节肠道免疫的机制。由已有研究知道，初始CD4+T 细胞在不同条件下可以被诱导分化成不同的T细胞亚群，包括具有免疫抑制作用的效应T 细胞Th1、Th2、Th17 和Treg。据报道TGF-β 信号通路在CD4+T 分化为Treg 中起重要作用，Smad3 是TGF-β/Smad 信号通路中的关键信号分子［20］。Foxp3 作为Treg 细胞的特异性标志物，其基因的表达受到磷酸化Smad3 的直接调控［22］。因此，进一步探讨了TGF-β/Smad3 信号通路在B.fragilis增强结肠中Treg 细胞表达和缓解结肠炎过程中的调控机制。

Figure 2 B.fragilis treatment alters intestinal floraA: Scheme of B. fragilis treatment in experimental colitis; B: Principal Coordinate Analysis (PCA) of gut microbiota in DSS, DSS+B. fragilis and NC mice; C:The alpha diversity analysis of intestinal flora, shown as observed species and Chao 1; B.gilis group (DSS+B.fragilis group); D: Beta diversity analysis of intestinal flora; E,F: Relative abundance of the top 10 most abundant species at the phylum(E) and genus(F) level in NC, DSS (C1-5) and DSS+B.fragilis(B1-6) treated mice. Each bar represents a sample (NC n=6, DSS n=5, DSS+B.fragilis n=6)

本研究通过对小鼠尾静脉注射针对Smad3 的siRNA，对其基因表达进行干扰，构建了Smad3敲低小鼠，并在此基础上进行了实验。用磁珠分离脾脏初始CD4+T 细胞，当分选率达到90%以上时，进行体外细胞转染实验（图5-A）。在CD4+T细胞中通过转染siRNA，筛选获得可有效敲低Smad3 表达的siRNA 序列后（图5-B），在小鼠体内静脉注射脂质体修饰的siRNA。设置NC组、B.fragilis组、siSmad3+B.fragilis组和siSmad3+NC组。根据Western blot 结果显示，与B.fragilis组相比，siSmad3+B.fragilis组p-Smad3 表达明显下调，siSmad3+NC 组的表达也比NC 组降低。尽管如此，B.fragilis处理的小鼠表现出p-Smad3 表达的增加。此外，在B. fragilis治疗组中观察到结肠Treg的比例显著升高，当Smad3被敲低时Treg 比例降低（图5-D）。结肠H&E 染色的结果还表明，Smad3 敲低后给予小鼠B. fragilis治疗不能有效的减轻小鼠结肠炎（图5-E）。

这些数据表明，Smad3敲低可以抑制B.fragilis在增加肠道Treg 和缓解肠道炎症中的作用。综上所述，B. fragilis通过TGF-β/Smad3 信号通路在肠道免疫调节中发挥作用，从而调节肠道免疫平衡。

Figure 3 B.fragilis treatment alters SCFAs production （± s, n = 5）A−F: Production of acetic acid, propionic acid, butyric acid, isobutyric acid, valeric acid and isovaleric acid*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001

3.4 B.fragilis通过增加肠道ROS激活TGF-β

之前的研究表明，在B. fragilis治疗后，肠道Treg 显著增加，并且Treg 的分化受到TGF-β/Smad3的调节。据报道，ROS 是激活TGF-β 的因素之一。因此，可怀疑在结肠炎小鼠中的B. fragilis治疗可能对ROS 的表达产生影响，从而导致TGF-β 的激活。

为了验证假设，本研究构建了小鼠结肠炎模型，并如前所述给予B. fragilis治疗。正如预期的那样，在结肠炎小鼠接受治疗后，在结肠中观察到更高水平的ROS（图6-A）和TGF-β（图6-B）表达，这表明ROS 在TGF-β 激活中起重要作用。以上结果表明，B. fragilis可通过增加肠道ROS 的产生来激活TGF-β，从而诱导Treg 分化并增强肠道调节免疫。

综上所述，给予B. fragilis可以改善结肠炎引起的肠道菌群失衡，增加SCFAs 的产生。此外，B.fragilis能够增加肠道中的ROS，激活TGF-β，进而通过TGF-β/Smad3 信号通路诱导肠道Treg 细胞分化，增强肠道调节免疫，减少肠道炎症（图7），这为结肠炎的治疗提供了新思路。

4 讨 论

炎症性肠病（IBD）是复发性的，难以治愈的，其病因和发病机制尚未完全明确，通常认为是由多种因素（如遗传、免疫和环境）相互作用引起的。对于细菌等原因引起的肠道炎症，人们经常使用抗生素治疗相当长的时间，但抗生素引起的菌群紊乱往往带来很多副作用［23］。肠道菌群已成为炎症性肠病治疗的研究热点。近年来，粪便菌群移植（FMT）已被证实可以通过恢复肠道菌群组成，缓解肠道炎症，取得有效的治疗效果，已应用于临床［24-25］。

Figure 4 B.fragilis enhances intestinal regulatory immunity by expanding TregA, B: Body weight (A) and colon length (B) of DSS-treated and DSS+B.fragilis-treated mice (± s, n = 6, * P ＜ 0. 05,****P ＜ 0.000 1) ; C: H&E staining of colons and histological score, including mucosal injury and inflammatory infiltration (± s, n = 3, **P ＜ 0.01,***P ＜ 0.001); D: Frequency of colonic CD4+ Foxp3+ Treg in DSS and DSS+B.fragilis treated mice by flow cytometry (± s, n = 3, **P ＜ 0.01 vs DSS group); E: Flow cytometry analysis of colonic IL-10 expression by Multifactor kit (± s, n = 3, *P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01 vs DSS group); F: Expression of ZO-1 in colon detected by immunofluorescence. ZO-1 (red) and nuclei stained with DAPI (blue). Scale bar, 200 μm (left) and 50 μm(right), n = 6

Figure 5 B.fragilis induces Treg to reduce colitis through TGF-β/Smad3 pathwayA: Flow cytometry analysis of initial CD4+ T cells isolated from spleen of WT mice; B: Expression of Smad3 after transfection with siRNA against Smad3 in CD4+ T cells by qPCR (± s, n = 3, * P ＜ 0. 05 vs si-nc group,ns: not significant); C: Western blotting analysis of the expression of p-Smad3 in the colon isolated from DSS, DSS+B. fragilis and Smad3 knocked-down treated with or not with B. fragilis mice; D: Flow cytometry analysis shows the effect of Smad3 knockdown in the frequency of Treg in different groups (± s, n = 3, * P ＜ 0. 05,**P ＜ 0.01); E: H&E staining of colons

Figure 6 B.fragilis activates TGF-β through increased ROSA: Events and mean fluorescence intensity (MFI) of ROS in colonic CD4+ T cells of DSS (red boxes) and DSS+B.fragilis (green boxes) treated mice by flow cytometry (± s, n = 5, *P ＜ 0. 05); B: Expression of TGF-β in colon by ELISA (± s, n = 5, ** P ＜ 0. 01)

Figure 7 Bacteroides fragilis regulates intestinal flora balance and controls intestinal inflammation through promoting Treg differentiation via TGF-β/Smad3 signaling pathway

将健康小鼠的细菌移植到结肠炎小鼠中，可以促进紊乱的菌群结构向正常菌群的转化，增加肠道T细胞和抗原呈递细胞的表达和功能，促进抗炎细胞因子IL-10 的分泌。从而使肠道菌群转化为正常菌群，调节肠道免疫平衡，缓解肠道炎症［1］。此外，相关益生菌在肠道疾病中的作用已被越来越多的研究证明。尽管一些研究表明，拟杆菌门中的B.fragilis可以通过增加Treg 的表达来增强肠道免疫耐受性，但其机制仍有待进一步研究［23］。SCFAs是肠道菌群的代谢产物，也在调节免疫力中发挥作用［26］。本研究表明，结肠炎小鼠补充B.fragilis可以提高其肠道有益菌的多样性和丰度，同时检测到其肠道中SCFAs 显著上调；也检测到小鼠结肠中Treg 细胞比例和抗炎细胞因子IL-10 的表达水平显著上调，同时肠道中紧密连接蛋白ZO-1 的表达上调增强了肠黏膜屏障功能。在机制方面，本研究发现B.fragilis可以上调肠道中的ROS，结肠中TGF-β 被激活，其重要的信号传导分子Smad3 磷酸化显著上调，以上实验结果为解释B.fragilis上调结肠中Treg 细胞比例提供了合理的思路。

之前的相关报道称SCFAs 通过调节免疫细胞趋化性，ROS 释放和细胞因子释放发挥抗炎功能［27］。研究表明，SCFAs 可以调节肠道Treg 细胞的数量和功能，并发挥抗炎作用［26］。丁酸盐通过抑制人单核细胞IL-12 的产生［28］和上调IL-10 的产生［29-30］来发挥抗炎作用。SCFAs 可以抑制巨噬细胞和中性粒细胞中促炎细胞因子的释放。乙酸盐通过激活GPR43 促进小鼠中性粒细胞的ROS 释放［31］。临床研究证明，丁酸盐在炎症部位具有直接的抗炎作用［32］。丁酸盐与多种人肿瘤细胞系中的抗癌活性有关，人结肠癌细胞上GPR109A 的激活与细胞凋亡有关，通过诱导细胞凋亡直接抑制结肠癌发展。它还可能通过增加 MCT-1 表达并随后增加丁酸盐转移到细胞中来间接起作用。丁酸盐转运蛋白SMCT-1 在结肠癌细胞中下调，表明其表达对结肠癌细胞的抗肿瘤功能至关重要［33］。本研究表明，B. fragilis可有效改善结肠炎引起的肠道菌群失衡，增加SCFAs 的产生，包括醋酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸等，从而维持肠道菌群稳态。结直肠癌（CRC）发病机制与肠道微生物群结构的变化和 SCFAs 的减少有关［34］。CRC细胞对SCFAs比正常结肠上皮细胞更敏感，表明SCFAs在细胞稳态中起重要作用。SCFAs 诱导的正常细胞和癌细胞生长之间的代谢差异可用于抑制CRC 中的肿瘤生长。因此，靶向调节SCFAs 的产生，调节细菌生态学，激活有效的抗癌作用可能是CRC 未来的有效治疗方法。

在本研究中，讨论了B. fragilis在改变肠道菌群以增强肠道调节免疫的作用。对机制进行了初步探索，为进一步研究B. fragilis治疗与炎症性肠病的关系提供了理论和实验基础。然而，肠道菌群是否可能通过其他免疫细胞或免疫途径调节机体的免疫力及其机制仍需进一步研究。