麻痹性贝类毒素分析检测净化处理方法研究进展

文/邵彪 许晶晶 高利亭 陈刚

麻痹性贝类毒素是一类毒性很强且具有高发性的海洋生物毒素，目前，主要的检测方法有小鼠生物法、酶联免疫法、液相色谱法以及液相色谱-质谱联用法等。由于毒素含量通常较低，且生物体基质干扰很大，选择合适有效的净化处理方法已成为分析检测的关键环节。本文综述了麻痹性贝类毒素分析检测净化处理方法及研究进展，以期为相关从业者提供参考。

一、引言

麻痹性贝类毒素（Paralytic shellfish poisoning，PSP）是在赤潮发生过程时，海洋中的贝类生物摄食了亚历山大藻、甲藻、蓝藻等有毒藻类，经过生物体内蓄积、放大和转化而形成的一类毒素，因误食含有此类毒素的贝类后会产生麻痹性中毒现象而得名。PSP种类繁多，现已发现50多种，基本结构为含有2个胍基的多叠六元环，结构式见图1。

图1 PSP化学结构式

不同PSP的差别主要是R1、R2、R3、R4取代基团的差异，根据基团的相似性可分为四类：（1）氨基甲酸酯类毒素，包括石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）、新石房蛤毒素（Neosaxitoxin，NEO）、膝沟藻毒素（Gonyautoxin，GTX，包括GTX1、GTX2、GTX3和GTX4）；（2）N-磺酰氨甲酰基类毒素（N-sulfocarbamoyl toxins），包括C1、C2、C3、C4、GTX5（B1）和GTX6（B2）；（3）脱氨甲酰基类毒素，包括Decarbamoyl saxitoxin（dcSTX）、Decarbamoyl neosaxitoxin（dcneoSTX）和Decarbamoyl gonyautoxins1-4（dcGTX1-4）；（4）脱氧脱氨甲酰基类毒素（Deoxydecarbamoyl toxins）。研究表明，PSP毒性强烈，能够抑制神经的传导，人体的中毒剂量为600MU～5000MU，致死量为3000MU～30000MU，目前还没有有效的解毒方法，全球每年因麻痹性贝类毒素而引发的中毒事件约2000起，具有广布性和高发性等特点。因此，国内外均进行了严格管控，并以石房蛤毒素为指标制定了限量标准。世界卫生组织（WHO）规定100g贝类可食部分的PSP限量为80μg STX eq/100g，我国现行的GB2733-2015《鲜、冻动物性水产品卫生标准》规定PSP最大限量为4MU/g，两者数值基本一致。

二、现有检测技术特点

为了有效检测麻痹性贝类毒素，国内外学者研究开发了多种分析方法，其中，最主要的有小鼠生物法、酶联免疫法、液相色谱法以及液相色谱—质谱联用法，目前，这四种方法均已列入我国现行的检测标准GB 5009.213-2016中。

小鼠生物检测法（Mouse bioassay，MBA）是全球范围广泛使用的经典方法，通过观测小鼠腹腔注射待测样品提取液后的死亡时间，并根据麻痹性贝类毒素致小鼠死亡时间与鼠单位关系的对照表以及小鼠体重校正系数，获取样品中PSP的鼠单位，也可用石房蛤毒素作为标准换算成毒素的质量数。该方法直接反应麻痹性贝类毒素毒性总量，前处理简单，仅需用酸性提取液均质浸提，加热煮沸，采用自然沉降、过滤或低速离心的方式获取上清液即可。但该方法不具特异性，无法确定毒素的成分和结构，同时受小鼠个体差异影响不确定因素较多，存在灵敏度低、重现性差、易出现假阳性等问题，此外，由于涉及动物实验以及实验室许可资质的因素，限制了其在常规实验室的使用。

酶联免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是基于抗原抗体之间特异性反应，通过酶标物与酶反应底物发生显色反应，根据颜色的深浅来进行定性或定量分析。由于酶联免疫法分析过程仅需使用酶标仪，无需使用复杂的仪器分析，因此，其前处理同小鼠生物法类似，仅需对样品中PSP进行有效提取，无需对样品进行净化处理。酶联免疫法操作简单，但存在现有商品化抗体种类仅覆盖少数的几种毒素、特异性低、易发生交叉反应等问题。

以液相色谱法、液相色谱-质谱联用法为代表的仪器法可以在具备标准品的前提下针对具体毒素种类进行定性、定量分析，结果准确可靠。然而，由于麻痹性贝类毒素种类多、结构相近、性质相似而液相色谱法是以保留时间定性，给实际分析造成很大困难，不少毒素成分很难实现有效分离。液相色谱—质谱联用法是以质谱定性，通过对化合物离子碎片进行定性及定量检测，对色谱分离效果要求不高，不仅在定性上更加精准，而且串联质谱能够很大程度降低干扰，带来更高的灵敏度。因此，液相色谱-质谱联用法逐渐成为麻痹性贝类毒素分析检测优选的方案。

三、液质联用法前处理技术

贝类等海洋动物生物体基质复杂，含有大量的蛋白质、脂肪等成分，这些成分不仅干扰目标物测定，而且还会对色谱柱、离子源造成污染，影响色谱分离和质谱信号，因此，合适有效的净化处理方法成为分析检测的关键环节。麻痹性贝类毒素具有极性强、易溶于水、酸性稳定以及热稳定性的特点，主要采取的提取方式是利用甲酸、乙酸、盐酸、乙腈-酸性水溶液等进行提取，辅以超声波、加热、超滤、有机溶剂处理等手段增强提取效果并去除蛋白、脂类等干扰物。同时，在进入液相色谱—质谱联用仪分析之前，通常还会采用固相萃取等净化处理方法进一步排除干扰。

根据现有报道，固相萃取所涉及的净化柱的类型广泛，包括HLB固相萃取、C18固相萃取、石墨化炭黑固相萃取、免疫亲和固相萃取、MCX固相萃取等，此外分散固相萃取QuEChERS技术也已见使用。这些技术的使用为麻痹性贝类毒素有效检测提供了参考和指导。

（一）HLB固相萃取柱净化

HLB固相萃取柱是亲水亲脂平衡柱，填料含有特定比例的亲水基N-乙烯基吡咯烷酮结构和疏水基二乙烯基苯结构，可以分别保留极性化合物和非极性化合物。PSP作为极性化合物，能够被HLB固相萃取柱吸附并得到广泛应用。

有研究采用0.5%甲酸溶液加热提取，经乙酸乙酯、三氯甲烷和HLB固相萃取柱净化，乙腈去蛋白后，建立了GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、dcSTX、neoSTX、STX等10种麻痹性贝类毒素（PSP）的高效液相色谱-串联质谱检测方法。在50μg/kg～600μg/kg添加水平下，10种麻痹性贝类毒素平均回收率为72.3%～91.1%，相对标准偏差为3.9%～9.5%，STX、dcSTX、neoSTX定量限为100μg/kg，GTX1～GTX5、dcGTX2和dcGTX3的定量限为50.0μg/kg。另有研究以0.1mol/L乙酸提取，HLB固相萃取小柱净化，10000MW超滤，建立了贝类产品中STX、neoSTX、GTX1＆4、dcSTX、dcneoSTX、dcGTX2＆3等8种麻痹性贝类毒素的高效液相色谱-串联质谱测定方法，8种麻痹性贝类毒素的定量限为10μg/kg～50μg/kg，平均加标回收率为75.5%～103.0%，相对标准偏差为4.3%～13.2%。有学者采用含0.1%乙腈-水溶液（80:20，v/v），HLB固相萃取小柱净化，建立了同时定量分析双壳类软体动物中的12种麻痹性贝类毒素（STX、NEO、dcSTX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、C1、C2、dcGTX2和dcGTX3）的超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）方法。

（二）C18固相萃取柱净化

C18固相萃取柱是以十八烷基硅胶为填料，通过强疏水作用保留非极性化合物，在食品安全、环境等检测领域应用广泛。C18固相萃取柱对PSP无保留，而是通过吸附提取液中杂质，实现对样品的净化目的。

有研究采用0.1N盐酸提取，并利用C18固相萃取柱进行净化，建立了贝类和被膜动物中STX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4液相色谱-串联质谱法，平均回收率为82.7%～110.7%，日内精密度为0.3%～10.9%，日间精密度为0.8%～10.0%，定量限为25μg/kg～100μg/kg。有学者采用0.2mol/L的乙酸水溶液对贝类组织中PSP进行提取，C18固相萃取柱净化，以Atlantis HILIC Silica色谱柱为分析色谱柱，以2mmol/L甲酸铵（含0.1%甲酸）和乙腈为流动相进行梯度洗脱，质谱采用多重反应监测模式（MRM），4种麻痹性贝类毒素在浓度10ng/mL～100ng/mL内线性关系良好，STX、dcSTX、GTX1＆4、GTX2＆3的方法检出限（LOD）为1.1μg/kg、1.8μg/kg、2.5μg/kg、2.3μg/kg，平均加标回收率在85.6%～95.4%，相对标准偏差小于5%。

（三）石墨化炭黑固相萃取柱净化

石墨化炭黑固相萃取柱对平面分子或者含有平面芳香环的分子具有极强的吸附作用，且呈正电性，具备反相和离子交换双重保留机制，既能保留非极性化合物，也能保留强极性化合物。

为了减少基质效应，有研究用乙酸水溶液提取贝类中的PSTs，经乙酸乙酯除杂，然后用石墨化碳黑固相萃取柱净化，13种PSTs的线性方程相关系数（r）均大于0.998，定量限为2μg/kg～20μg/kg，贻贝基质、牡蛎基质、扇贝基质的平均回收率为92.2%～122%、106%～129%、107%～144%，相对标准偏差均小于11%。有学者用0.5%乙酸水提取，石墨化碳黑固相萃取柱净化，采用高效液相色谱—串联质谱法分析了7种双壳贝类508份样品中的STX、neoSTX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcSTX、dcGTX2、dcGTX3，经验证，GTX1、GTX2、dcGTX2检出限分别为64.0μg/kg、48.0μg/kg、68.0μg/kg，其余PSP检出限均为20.0μg/kg，方法回收率为71.6%～116.3%，相对标准偏差为4.7%～16.3%。有研究以乙酸水溶液提取，石墨化碳黑固相萃取净化，液相色谱—四极杆/线性离子阱复合质谱分析，建立了双壳贝类中13种麻痹性贝类毒素（STX、NEO、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3、C1、C2）的定性确证和定量分析方法，基质加标平均回收率为（79.6±10.4）%～（98.8±6.54）%。还有学者利用1%乙酸水溶液提取，选择离子对固相萃取柱石墨化碳黑固相萃取柱净化，以十三氟庚酸作为挥发性离子对试剂，开发了双壳类样品中GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、GTX6、dcGTX2、dcGTX3、C1、C210种麻痹性贝类毒素和河豚毒素的同时检测技术，其中10种PSP的检测限和定量限分别为0.09μg/kg～13.0μg/kg和0.26μg/kg～39.4μg/kg，平均回收率为75.7%～96.2%，三个水平的加标所测相对标准偏差小于16%。

（四）免疫亲和柱净化

免疫亲和柱净化技术原理是通过抗原和抗体之间的特异性结合实现对目标物的吸附，具有净化效果好、无基质效应的特点，特别适用于微量成分的处理。针对不同种类样品无需基质匹配，更适宜于超痕量目标化合物的检测。

有学者制备了抗PSP单克隆抗体免疫亲和柱，用于纯化PSP贝毒GTX2,3，实现将麻痹性贝毒的GTX2,3与GTX1,4分离。有的研究中利用纯化的STX单克隆抗体与琼脂糖凝胶（sepharose 4B）制备了STX免疫亲和柱，采用11种麻痹性贝类毒素标液进行过柱实验，结果表明STX免疫亲和柱对STX、GTX5、dcSTX、GTX3有较好的吸附效果，回收率均在61.2%～99.0%，能够满足样品检测前处理的要求。同时，利用磷酸盐缓冲液（PBS）提取双壳类中的STX并运用STX免疫亲和柱净化，建立了基于免疫亲和作用机理的SPE净化的高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测双壳类水产品中STX的方法。STX在2.468μg/kg～246.8μg/kg内具有良好的线性关系，相关系数r大于0.999。回收率为79.3%～102.9%，方法选择性好，消除了基质效应，无需基质匹配，可满足双壳类水产品中痕量STX的检测要求。

（五）MCX固相萃取柱净化

MCX固相萃取柱所用净化填料为混合型强阳离子交换吸附剂，具有反相和阳离子交换双重保留性能，对碱性化合物有良好的保留能力。

有学者建立了一种液相色谱—串联质谱（LC-MS/MS）法，可以同时测定贝类产品中GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、dcNEO8种麻痹性贝类毒素。样品经乙腈除蛋白后用1%三氯乙酸提取，提取液经正己烷脱脂，MCX固相萃取净化后，采用液相色谱进行分离，以选择反应监测（SRM）正离子模式进行质谱分析，8种麻痹性贝类毒素的定量限为100μg/kg～450μg/kg。以标准加入法计算回收率，在100μg/kg～300μg/kg平均回收率为76.3%～95.6%，相对标准偏差为4.3%～13.2%。

（六）QuEChERS净化处理

QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）是近年兴起并快速得到应用推广的一种前处理方法，其本质是分散固相萃取，原理与固相萃取相似，借助吸附剂填料与基质中的杂质相互作用，达到除杂净化的目的，具有处理速度快、操作简单、价格便宜、回收率高、稳定性好、安全风险低等优势，在农产品等检测领域被广泛使用。

有学者采用含0.1%甲酸的乙腈/水（90:10，v/v）提取，并用HLB和石墨化炭黑作为QuEChERS吸附剂进行净化，建立了海产品中的10种麻痹性贝类毒素HILIC-MS/MS检测方法，在8.1μg/kg～225.5μg/kg内对毒素进行三种水平的加标实验，平均回收率为71.3%～104.6%，相对标准偏差低于15.8%，检测限低于170μg/kg。Mattarozzi等提出了一种快速、简单的QuEChERS样品处理方法，样品用0.1%甲酸提取，利用ABS Elut NEXUS（包含硫酸镁、PSA、C18等吸附剂）净化，采用液相色谱-串联质谱实现了对STX、NEO、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3的检测，两个水平的加标回收率在79%～113%，相对偏差小于7%。

麻痹性贝类毒素检测的几种方法中，小鼠生物法、酶联免疫法对于样品前处理要求不高，所以采用净化处理手段较为简单，但如前文所述，这两种方法因自身特点在实际使用中受到较大限制。而以液相色谱-质谱联用为代表仪器法则需要提取后采用净化处理手段，尽可能排除基质干扰，同时保护色谱柱及质谱系统。本文对现有主要固相净化处理方式进行了简要概述，随着新材料的开发以及新技术的应用，石墨烯、分子印迹聚合物等净化处理填料和技术可望用于麻痹性贝类毒素检测前处理。