产气荚膜梭菌检测方法研究进展

王建东，王景松,，王健霖，李继东，郭亚男*

（1.宁夏农林科学院 动物科学研究所，宁夏 银川 750002；2.宁夏大学 动物科技学院，宁夏 银川 750021）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）又称产气荚膜芽孢杆菌、魏氏芽孢杆菌和魏氏梭菌，是一种革兰氏阳性专性厌氧杆菌，可形成芽孢，不能运动[1-2]。产气荚膜梭菌在环境中分布广泛，包括污染的水、食物和土壤中。产气荚膜梭菌也是人和其他动物胃肠道微生物群的组成部分，属于条件致病菌。在临床上，人和动物的气性坏疽、食物中毒、非食源性腹泻、肠炎和肠毒血症等疾病都与产气荚膜梭菌有一定关系[3-4]。产气荚膜梭菌致病性与其能产生20余种毒素和酶，即α、β、ε、ι、肠毒素、NetB、κ、μ、θ、PFO和β2等[1,5-6]是密不可分的，而且大多数疾病都由这些毒素中的一种或多种介导。由于不同菌株所产生的毒素有很大不同，这种差异性使得产气荚膜梭菌分离株可以根据所产生的毒素进行分类，这种分型方式称为毒素分型。Rood等[7]对毒素分型方案进行了修改和补充，根据α、β、ε、ι、肠毒素和NetB 6种主要毒素，将产气荚膜梭菌分为7种毒素类型，即A型（产α毒素）、B型（产α、β、ε毒素）、C型（产α、β毒素，部分产cpe）、D型（产α、ε毒素，部分产cpe）、E型（产α、ι，部分产cpe）、F型（产α、cpe）和G型（产α、NetB）。不同类型的产气荚膜梭菌对动物所产生的影响有所不同，所以需准确判断产气荚膜梭菌毒素类型。因此，本文对目前产气荚膜梭菌主要毒素的检测方法进行总结，为后续快速诊断方法的建立以及相关研究提供一定参考。

1 产气荚膜梭菌检测方法研究进展

产气荚膜梭菌引起动物感染发病的主要因素取决于细菌产生的外毒素和酶。为控制产气荚膜梭菌病的传播，减少或避免给畜牧养殖业造成的严重经济损失，必须快速且准确地确定该菌的毒素基因型。临床上一般通过了解病史、临床症状和病理剖检等对是否患有产气荚膜梭菌病作出初步判断，但确诊还需要进行实验室诊断。实验室诊断方法目前主要包括微生物学检测法、免疫学检测法以及分子生物学检测法。

1.1 微生物学方法

实验室微生物学方法是将样品进行预处理，接种至专性培养基37 ℃厌氧培养18～24 h后，挑取疑似菌落进行扩大培养，革兰氏染色镜检，最后通过生化试验等进行确认。产气荚膜梭菌的微生物学检测方法可以参考GB 4789.13—2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》中的缓冲动力-硝酸盐试验、乳糖-明胶以及含铁牛乳发酵试验进行复检确认，也可以利用反向CAMP试验：用无乳链球菌在血平板上划线，疑似产气荚膜梭菌的样品垂直于无乳链球菌划线，厌氧培养24～48 h后，由于协同溶血作用，将形成一个“蝴蝶结”带，即可验证。

1.2 免疫学方法

免疫学方法是利用特异性免疫原理建立的检测方法。与细菌学诊断方法相比，具有取样便捷、样品用量少、可靠性强、灵敏度高、便于操作等优点[8]。毒素中和试验是最早和最经典的检测方法之一。酶联免疫吸附法（ELISA）属于免疫学方法中的一种重要检测方法。王武斌等[9]以纯化的产气荚膜梭菌etx毒素重组蛋白作为包被抗原，构建了etx毒素间接ELISA检测方法，其血清灵敏度为1∶3 200，灵敏度和特异性良好。马玲玲等[10]以产气荚膜梭菌CPB1毒素作为包被抗原，建立了CPB1抗体的间接ELISA检测方法，其特异性、灵敏度和重复性均较高。cpa毒素、β1毒素、β2毒素等均已作为包被抗原被构建为产气荚膜梭菌的间接ELISA检测方法[11-13]。陈长俊等[14]以抗α毒素单克隆抗体为捕获抗体，抗α毒素多克隆抗体为检测抗体，建立了检测α毒素的双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）检测方法，其特异性、灵敏度良好。

1.3 分子生物学技术

随着近些年科研水平的不断提高，分子生物学也得到了快速发展，将分子生物学技术应用于病原分析鉴定也越来越广泛。实验室诊断技术也从常规的微生物学检测和免疫学检测发展为分子生物学检测。分子生物学检测技术除了传统的基础PCR方法外，还出现了多重PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增技术（Loopmediated isothermal amplification，LAMP）以及重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification，RPA）等新型分子生物学技术手段，利用这些方法可以鉴定细菌菌型以及判定其致病性。

1.3.1 16S rRNA PCR技术 16S rRNA基因序列全长约1 500 bp，是原核生物中编码核糖体16S rRNA的DNA序列，存在于细菌、支原体等所有原核生物中，因具有特异性和稳定性，常用于原核生物的初步鉴定。在PCR中使用全长16S rRNA通用引物进行基因扩增并测序，将测序结果进行生物信息学鉴定，基于序列相似性＞97%来指定分类学，在检测食品中的产气荚膜梭菌中也有所应用[15]。

1.3.2 普通PCR技术 普通PCR技术又称聚合酶链式反应，是在生物体外进行特殊的DNA复制，通常利用变性、退火、延伸三步法进行体外扩增。1993年，Fach P等[16]建立了产气荚膜梭菌cpa毒素的检测方法，可直接用于粪便样本的检测。Uzal等[17]针对产气荚膜梭菌α、β、ε和ι 4种毒素基因设计了4对特异性引物，分别进行PCR扩增反应，可用于检测不同类型的产气荚膜梭菌。2004年，梁光军等[18]建立了可扩增α毒素全基因的PCR检测方法。单一PCR每次只能扩增1种靶基因，因此对产气荚膜梭菌定型就需要多次反应。于是，1次反应即可检测多个靶基因的多重PCR技术应运而生。

1.3.3 多重PCR技术 多重PCR技术是在单一PCR基础上发展而来的PCR技术，其特点是能够在反应体系中加入多种引物，从而扩增出多条带的PCR方法。其原理与单一PCR基本相同。2004年，Baums等[19]建立的多重PCR，利用高温将产气荚膜梭菌菌液裂解作为模板进行产气荚膜梭菌cpa、cpb、etx、ia、cpb2和cpe毒素基因的检测，减少了提取产气荚膜梭菌基因组的步骤，极大地节省了检测时间。2005年，Heikenheimo等[20]通过经典毒素试验和多重PCR证实了2种方法对C.perfringens的分型结果一致，并且其特异性和敏感性均比毒素中和试验高。张凯川等[21]以产气荚膜梭菌cpa基因、艰难梭菌Glud基因、脆弱拟杆菌Lue基因为靶基因，建立了快速检测厌氧菌引起的细菌性腹泻多重PCR检测方法，其最低检测下限分别为1.6×10-2pg/μL、0.7 pg/μL和2.8 pg/μL。唐娜等[22]以小反刍兽疫病毒N蛋白基因和产气荚膜梭菌α毒素基因建立了双重PCR检测方法，检测下限分别达到0.001 TCID50/mL和10 个CFU/mL，实现了小反刍兽疫病毒与产气荚膜梭菌的鉴别诊断。2013年，董洁等[23]根据α、β、ε、ι毒素基因序列构建了C.perfringens定型的菌落多重PCR，可以鉴定A、B、C、D、E 5个型，并对106份样本进行检测，鉴定出30株C.perfringensA型。2022年，缪西鹏等[24]以产气荚膜梭菌α、β、ε、ι毒素的基因序列为靶基因，构建四重PCR检测方法，通过对样本检测并与GB 4789.13—2012《食品安全国家标准 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》进行对比，结果高度一致。张凯悦[25]建立了cpa、cpb、etx、itx、cpe和netB毒素基因的六重PCR，通过对34株已知样品进行检测，结果与菌株的分型一致。多重PCR技术简单、经济，通过1次反应即可检测出多种靶基因，不仅节省试剂和时间，而且能达到理想的对比效果，从而准确鉴别产气荚膜梭菌毒素类型[26]。

1.3.4 环介导等温扩增技术 LAMP是一种新型的核酸扩增技术。该技术主要依靠一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在恒温条件下快速扩增DNA，既有较高的特异性，又具备较高的扩增效率，而且反应时间只需1 h左右[27]。王朋冲等[28]建立了快速检测产气荚膜梭菌α毒素的LAMP检测方法，灵敏度高，对产气荚膜梭菌的DNA检测下限为10 ng/L，对产气荚膜梭菌菌液的检测下限为3.7×102CFU/mL，比普通PCR灵敏10～100倍；反应时间为62 ℃水浴40 min，80 ℃ 10 min终止反应，对牛粪便样品、饲料和饮水进行检测时，检出率为19.61%，与PCR检测和细菌分离鉴定结果一致。Radhika B等[29]利用自身构建的产气荚膜梭菌α毒素的LAMP检测方法，对120份疑似肠毒血症粪便样本进行检测，LAMP和PCR检测cpa毒素基因，112份（93.3%）阳性，检测结果一致，灵敏度相同。

1.3.5 重组酶聚合酶扩增 RPA是一种恒温核酸扩增技术，主要利用重组蛋白酶和单链结合蛋白等物质参与反应，可在37 ℃左右条件下30 min内完成对靶基因的检测，无需高温变性、退火、延伸等步骤。该技术具有特异性强、灵敏度高等特征，目前已被广泛应用于多种食源性致病菌的快速检测。许笑等[30]以产气荚膜梭菌α毒素的编码基因plc为靶基因进行引物和探针设计，建立了鸡源产气荚膜梭菌的real-time RPA快速诊断技术，该方法可在38 ℃、25 min内完成检测，检测下限为1×10 copies/L，并且与qPCR检测方法检测结果一致，但比qPCR的检测时间缩短了近一半。刘立兵等[31]以保守性强的产气荚膜梭菌plc基因序列为靶基因，建立了实时荧光RPA检测方法，其检测下限为1.3 pg/μL和1.0×102CFU/mL，只需要3～13 min即可完成样品检测，特异性强，操作方便。

RPA在引物设计上要求高，引物序列长度控制在30～35 bp，扩增片段大小在100～500 bp，扩增效率更高，但也有学者将扩增片段设计到1 000 bp，也可扩增出靶基因片段。同时RPA较高的灵敏度使其极易出现污染或假阳性。目前为止还未研发出专门用于设计RPA的引物软件。

1.3.6 TaqMan荧光定量PCR TaqMan荧光定量PCR以其探针的特异性可用于多种靶基因检测，已广泛应用于科学研究、食品检测、临床医学检测与诊断等领域[32-34]。2004年，Wise等[35]建立的产气荚膜梭菌16S rRNA荧光定量PCR，可检测50 fg产气荚膜梭菌菌体。2007年，Gurjar等[36]构建了产气荚膜梭菌cpa、cpb、etx、ia、cpb2和cpe多毒素二重TaqMan荧光定量PCR，其分别以cpa和cpb2、cpb和etx以及ia和cpe三个体系同时进行，对307份牛粪便进行检测，检测结果显示，cpa、cpb、ia、etx、cpb2和cpe毒素基因分别检测到68份（28.2%）、6份（2.5%）、6份（2.5%）、4份（1.6%）、164份（68%）和11份（4.6%）。2011年，石玉玲等[37]以产气荚膜梭菌16S rRNA为目的基因，构建了产气荚膜梭菌TaqMan荧光定量PCR，对纯菌液的检测下限为9×102CFU/mL，可对气性坏疽快速诊断进行准确报告。2016年，张蓉蓉等[38]以产气荚膜梭菌α和cpe毒素为目的基因，构建双重荧光定量PCR方法，其灵敏度、特异性、重复性均较好。2017年，郑萍等[39]针对水中产气荚膜梭菌α毒素基因构建单重荧光定量PCR检测方法，其灵敏度达到10 copies/μL，对16种细菌进行特异性验证均为阴性。2020年，李一鸣等[40]对产气荚膜梭菌α、β、ε毒素基因序列设计特异性引物和TaqMan探针，构建了可鉴定羊源产气荚膜梭菌A、B、C和D型的三重荧光定量PCR检测方法，其灵敏度可达到1×102copies/μL。2020年，学者根据产气荚膜梭菌高度保守的plc基因设计特异性引物和探针，建立了产气荚膜梭菌的实时荧光定量PCR，其检测下限为1.3 pg/μL和1.0×102CFU/mL，仅需24～46 min（Ct值为17.45～33.65）即可完成检测，其特异性强、灵敏度高、操作方便[31]。2021年，刘嘉琳等[41]对猪大肠杆菌irp2基因、沙门氏菌fim基因和产气荚膜梭菌plc基因进行特异性引物和探针设计，构建了同时检测3种病原的多重荧光定量PCR检测方法，其产气荚膜梭菌最低检测下限为4.37×103copies/μL。

2 结语

随着新型技术的开发和应用，有关产气荚膜梭菌检测方法的研究也日益深入，本文对目前产气荚膜梭菌主要检测方法进行了总结，每种检测方法均有一定的优缺点，相信随着科技的不断进步，产气荚膜梭菌的检测方法也会日益完善。