芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的网络药理学机制研究

谢 婷，刘静霞，吕瑞民

1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040

葡萄膜炎（Uveitis）是发生于葡萄膜等多个部位的炎症致盲性眼病，青壮年容易罹患，常反复发病，可引起青光眼、白内障等严重的并发症，导致了全球5%～10%的视力障碍，发病率具有地域、人群、类型、病因等因素之间的差异性。可由于感染因素（细菌、真菌、寄生虫、病原体等）发病，还可由于非感染因素导致，例如自身免疫的因素（CD4+T细胞及相关的细胞因子等）、创伤和理化损伤以及免疫遗传的因素［1-2］。临床比较普遍的治疗手段多为在局部或者全身使用糖皮质激素，免疫抑制剂和生物制剂等，虽效果确切，但亦有许多严重副作用，且中止用药后很容易再发，降低了病人的生活品质［3-4］。葡萄膜炎属于瞳神疾病，病因有外邪攻于目，或脏腑病变连及目，病位涉及黄仁、视衣、神水、神膏等，主要与肝、脾、肾功能失调相关［5］。中医药具有治疗效果好、副作用小、多成分、多靶点、多渠道的优点，在治疗葡萄膜炎方面，中药可以达到降低炎症的水平、恢复功能的治疗效果［6-7］。芍药甘草汤是经过古今中医临床广泛使用且疗效上佳的方子，出自张仲景的《伤寒论》，由“白芍”和“甘草”两味中药构成，合用有酸甘化阴、调和肝脾、柔筋止痛之功，现代研究证明有抗炎和免疫调节等多种药理作用［8］。芍药甘草汤治疗葡萄膜炎临床效果显著，能改善实验性免疫性大鼠的临床体征［9-10］。网络药理学是从整体上探究药物在分子层面上对疾病发生治疗作用机制的一种方法，与祖国医学整体观念与辨证论治的原则相吻合，运用网络药理学的方法研究中医药治病的作用机理是一种新兴趋势［11］。本文基于网络药理学研究探析芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的作用机制。

1 资料与方法

1.1 中药活性成分和作用靶点的获取

以“白芍”和“甘草”为关键词，在TCMSP查找，得到两味药活性成分，以“口服生物利用度≥30%，类药性≥0.18”为条件进行筛选。得到的成分在TCMSP上收集靶点。在UniProt 蛋白质数据库上选定“人”的物种，将收集得到的靶点基因用UniProt名称表示。

1.2 “中药—成分—靶点”网络构建

将信息上传到Cytoscape 3.8.0 版本的软件对“中药—成分—靶点”之间的关系进行分析和构建网络。

1.3 疾病靶点和交集靶点的获取

以“uveitis”为搜索词，在GeneCards、OMIM、Dis-GeNET、DrugBank等数据库检索，获得疾病靶点。在Uni-Prot上选定“Reviewed”，并以“Human”为物种，将收集得到的靶点基因用UniProt名称表示。通过Venny将两味中药活性成分和疾病两者所有的UniProt 靶点基因名称取交集并绘制韦恩图，获得交集靶点基因。

1.4 蛋白—蛋白相互作用（PPI）网络构建

将交集靶点基因信息在STRING 中输入，物种上选择“Homo sapiens”，获得PPI数据文件，再将文件上传至Cytoscape进行分析数据以及构建PPI网络。

1.5 GO（Gene Ontology）基因功能和REGG富集分析

将交集靶点信息在DAVID 平台上传，进行富集分析，以P＜0.05 为筛选条件，将结果中排名靠前的用微生信在线工具作图。

2 结果

2.1 中药活性成分及作用靶点

在TCMSP 中获得白芍13 种成分，甘草92 种成分，共有成分有3 个，未找到相关靶点的成分白芍有5 个，甘草有4个，其余成分靶点去除重复靶点后有214个靶点。

2.2 “中药—成分—靶点”网络

将相关数据列入EXCEL 表后导入Cytoscape 构建网络图。该图由309 个节点（2 味中药、93 个成分和214 个靶点）和1 541 条边组成。成分中节点度前5 的是：槲皮素（GC85，quercetin，MOL000098）作用于139个靶点，山柰酚（A3，kaempferol，MOL000422)作用于113 个靶点，β-谷甾醇（BS4，beta-sitosterol，MOL000358）作用于36个靶点，7-甲氧基-2-甲基异黄酮（GC8，7-Methoxy-2-methyl isoflavone，MOL003896）作 用 于35 个 靶 点，柚 皮 素（GC11，naringenin，MOL004328）作用于32个靶点。

2.3 疾病靶点、交集靶点及PPI网络

在GeneCards、OMIM、DisGeNET、DrugBank 数据库检索中依次获得1 346、11、247、204 个靶点，去除重复项得到1 463 个靶点。成分与疾病靶点取交集得到93 个。将交集靶点导入STRING 后获得文件，再将文件上传至Cytoscape 得到PPI 网络图。此图包括93 个节点和1 680 条边，节点的面积变化依据degree 值而定，边线条的宽度变化由Combined Score 值决定，PPI 度值排名前20，见表1。

表1 芍药甘草汤与葡萄膜炎交集靶点PPI度值排名

2.4 GO和KEGG富集分析

将93 个交集靶点导入DAVID 平台，进行GO 和KEGG富集分析，P＜0.05 作为筛选条件，得到GO 项目结果显示：生物工程509 条，主要包括细胞因子介导的信号通路、药物反应、炎症反应、基因表达的正调控等；细胞组分40条，包括细胞外间隙、转录因子复合物、细胞外区、核质、高分子络合物、染色质等；分子功能85条，包括酶结合、转录因子活性，序列特异性DNA结合、蛋白质同源二聚化活性、转录因子结合、相同蛋白结合、细胞因子活性，蛋白质结合等。KEGG 通路145 条，主要涉及脂质与动脉粥样硬化、IL-17信号通路、Toll样受体信号通路、癌症的途径、肿瘤坏死因子信号通路、弓形虫病、Th17细胞分化等。选取GO 中P 值排名前10 以及KEGG 中P 值排名前20信息作图，见图1和图2。

图1 芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的关键靶点的GO富集分析

图2 芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的关键靶点的KEGG富集分析

3 讨论

葡萄膜炎的发病机制十分复杂，大多与细胞因子介导的免疫炎症反应相关。本研究共挖掘出芍药甘草汤活性成分93 个，成分潜在靶点214 个，葡萄膜炎疾病相关靶点1 463 个，“成分—疾病”交集靶点93 个。在芍药甘草汤“中药—成分—靶点”网络中，degree值较高的成分有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花素等。已有研究表明，槲皮素不仅能够进行免疫调节，还可以达到抗炎、抗氧化等疗效。槲皮素削弱了链球菌感染导致的细胞毒性，并抑制细菌刺激导致的IL-1β、IL-6 和TNF-α的释放，还推动了IL-10 的分泌［12-13］。山奈酚既具有抗炎的作用，还能够发挥抗氧化、抗癌的效果，通过增加活化巨噬细胞的数量来降低脂多糖(LPS) 导致发生TNF-α和IL-1的表达［14］。β-谷甾醇能通过抑制TNF-α、IL-17、IL-6 和IL-1β等炎症细胞因子引发的炎症反应而达到抑制颅内动脉瘤的生长的效果［15］。柚皮素也具有抗炎的作用，可以通过抑制NF-κb 通路、调节MMP-2 和MMP-9 等机制来减少促炎性细胞因子的分泌，比如炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β［16］。芒柄花素可以加快免疫活性细胞的生长，来达到在免疫抑制状态下的小鼠免疫功能得到加强的目的［17］。芒柄花素可以改善小鼠脑缺血再灌注损伤，降低炎性因子（IL-1β、TNF-α）的表达，从而可以抑制炎症反应［18］。

芍药甘草汤与葡萄膜炎“交集靶点”PPI 网络中degree 值较高的靶点有丝氨酸/苏氨酸激酶1（AKT1）、TNF、IL6、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、PTGS2等。AKT 家族有3 种亚型包括：AKT1（PKBα）、AKT2（PKBβ）和AKT3（PKBγ），其中AKT1 和AKT2 是广泛分布在哺乳动物组织中的。调节性T细胞对于维持自身耐受性和预防自身免疫至关重要，AKT通路在调节性T细胞发育、功能和稳定性中有着重要作用［19-20］。TNF-α是一种具有多种功能的促炎性细胞因子，包括炎症、免疫、细胞分化、细胞存活与死亡等，大部分是由活化的T淋巴细胞和单核巨噬细胞分泌的。TNF-α可以诱导IL-6 和IL-8 等细胞因子的释放［21］。IL-6 通常是在免疫、组织再生以及新陈代谢的过程中发挥作用，在先天免疫反应的过程中，IL-6通过感染或组织损伤部位的Toll样受体(TLR) 识别病原体后，由骨髓细胞（如巨噬细胞和树突细胞）迅速合成［22］。IL-6 也被确定为调节性T 细胞（Treg）和效应性Th17 细胞之间作用的重要调节因子。与转化生长因子（TGF）-β结合，IL-6可诱导Th17细胞分化，但是同时也抑制了TGF-β诱导的Treg的发育［23］。STAT3是一种在细胞生长、凋亡、炎症、癌变等活动中能发挥作用的信号转录蛋白，可以调节T细胞增殖和Th17分化，而T细胞中缺失STAT3 可防止中枢神经系统自身免疫性疾病的发展。STAT3 特异性单域抗体在体内能有效抑制Th17 和Th1 细胞，可以治疗器官特异性自身免疫性眼病［24］。PTGS2作为一种炎症介质，不仅是合成前列腺素(PG) 的关键酶, 也是前列腺素和血栓烷素的前体［25］。而前列腺素以及血栓烷A2可以形成炎症介质，进而引发葡萄膜炎症。

GO 功能结果表明了芍药甘草治疗葡萄膜炎参与了以细胞因子介导的信号通路、炎症反应、基因调控等多条生物过程。KEGG 通路结果主要是IL-17 信号通路、TNF 信号通路、Toll样受体信号通路、弓形虫病、Th17细胞分化等。IL-17 作为一种促炎因子，可以通过靶向视网膜色素上皮细胞导致炎症的发生，从而引起葡萄膜炎。Th17细胞能够分泌IL-17A、IL-17F、IL-22 和IL-21。因此，IL-17通路是Th17 细胞下游的主要治疗靶点。Toll 样受体（TLR）是能够感应病原体的关键受体,在对感染和细胞损伤的免疫反应中发挥着核心作用。TLR通过激活NF-κB或MAPK信号通路，能够活化下游转录因子，进而增加IL-6和TNF-α等炎性因子的表达。眼弓形虫病可以引起感染性葡萄膜炎，只有少数受感染的患者会出现眼部病变，称为弓形体视网膜脉络膜炎（TR）。研究证明了IL-6有调节TR炎症作用。CD4+T 细胞可以分化为T 辅助细胞（Th）或T调节细胞亚群。Th17 细胞属于Th。IL-6、IL-1β、IL-23和IL-21 等已被证明能促进Th17 细胞的分化，而IL-27、IL-2和IL-4等可以发挥抑制作用。

综上可知，芍药甘草汤可能是通过其多种活性成分（槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、柚皮素、芒柄花素等）作用于AKT1、TNF、IL6、STAT3、PTGS2 等靶点，调控IL-17信号通路、TNF通路、Toll样受体信号通路、弓形虫病、Th17细胞分化等通路，从而发挥调节免疫功能、抑制炎症反应的作用。本研究初步探明芍药甘草汤治疗葡萄膜炎的相关有效成分及多个作用靶点和通路，为拓展经方临床应用研究提供一定的理论依据和探索方向。