冠心病病人血清miR-34a、miR-145表达与冠状动脉病变程度的关系及相关机制研究

齐贵彬,高建步,张明磊,张永杰,王 星,彭小荷,董晓双,李京倡,刘 琳

我国冠心病的发病率和死亡率呈逐年升高的趋势,严重威胁居民的生命安全[1]。近年来,虽然冠心病诊疗技术得到了快速发展,但病人预后并未得到明显改善,主要与心血管不良事件发生率未有效降低有关[2]。目前,临床仍缺少评估冠心病病人预后的指标,给治疗方案的制定带来困扰。随着对微小RNA(miRNAs)在多种疾病中发生、发展作用的深入研究,逐渐发现miRNAs可作为心血管疾病预后的评价指标[3]。相关研究显示,miR-34a在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤组织中异常表达,并能促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[4-5];miR-145低表达参与胃癌、膀胱癌、宫颈癌、肝癌的发生与进展[6]。研究显示,miR-34a、miR-145在冠心病病人循环中存在异常表达,但与冠状动脉病变程度的关系和相关机制仍缺少深入研究[7-8]。因此,本研究探讨冠心病病人血清miR-34a、miR-145表达与冠状动脉病变程度的关系及相关机制。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2018年3月—2019年5月本院收治的冠心病病人60例作为冠心病组,其中,男32例,女28例;年龄47～65(56.79±5.41)岁。另选取健康志愿者60名作为对照组,其中,男34例,女26例;年龄45～65(56.28±4.95)岁。两组性别、年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。本研究经过医院伦理委员会审批,病人及家属知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入与排除标准 纳入标准:①经冠状动脉造影检查,存在1支及以上的主要冠状动脉血管狭窄程度>50%;②能够正常沟通交流,自愿参与本研究者。排除标准:合并恶性肿瘤、感染性疾病、免疫系统功能异常者。

1.3 主要材料与试剂 人血管内皮细胞株购于上海研谨生物有限公司;液体样本总RNA提取试剂盒购于上海西宝生物科技有限公司;胎牛血清、无血清细胞冻存培养基(RPMI)-1640购于上海源培生物科技股份公司;miR-34a minics质粒、miR-34a inhibitor质粒、miR-145 minics质粒、miR-145 inhibitor质粒均由上海吉玛公司构建;脂质体2000转染试剂购于美国Sigma公司;鼠抗人沉默信息调节因子1(SIRT1)单克隆抗体、鼠抗人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)单克隆抗体购于上海博湖生物有限公司。

1.4 方法

1.4.1 冠状动脉造影检查和随访研究 采用数字减影血管造影图像处理系统定量分析冠心病病人的冠状动脉狭窄程度,对冠状动脉造影检查结果进行Gensini评分,根据分值差异将冠状动脉狭窄程度分为轻度组(<50分,29例)、中度组(50～90分,19例)、重度组(>90分,12例)。病人出院后采取门诊复查、电话随访的方式,记录1年内心血管不良事件发生情况并分为心血管不良事件组(13例)和非心血管不良事件组(47例)。

1.4.2 标本采集与处理 冠心病组病人和对照组志愿者禁食12 h后,采集次日清晨外周静脉血4 mL,抗凝处理后,以3 000 r/min离心分离血清,使用总RNA提取试剂盒提取血清总RNA,-80 ℃保存待测。

1.4.3 细胞培养与转染 使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基传代培养人血管内皮细胞株。

1.4.3.1 miR-34a表达对冠状动脉病变程度影响机制的研究 取其中一部分人血管内皮细胞株用于miR-34a表达对冠状动脉病变程度影响机制的研究,分组如下:①正常对照组,采用常规培养;②白细胞介素-6(IL-6)组,使用10 mg/mL的IL-6刺激培养24 h之后常规培养;③空载体转染组、miR-34a低表达组、miR-34a高表达组,于实验前均使用10 mg/mL的IL-6刺激培养24 h后,空载体转染组转染空载体质粒,miR-34a低表达组转染miR-34a inhibitor质粒,miR-34a高表达组转染miR-34a minics质粒。

1.4.3.2 miR-145表达对冠状动脉病变程度影响机制的研究 取另一部分人血管内皮细胞株用于miR-145表达对冠状动脉病变程度影响机制的研究,分组如下:①正常对照组,常规培养;②氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)组,使用40 mg/mL的ox-LDL刺激培养24 h后常规培养;③空载体转染组、miR-145低表达组、miR-145高表达组于实验前均使用40 mg/mL的ox-LDL刺激培养24 h后,空载体转染组转染空载体质粒,miR-145低表达组转染miR-34a inhibitor质粒,miR-145高表达组转染miR-34a minics质粒。

1.4.4 逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测 使用总TRI试剂盒提取各组血管内皮细胞总RNA,同时将血浆总RNA取出。采用互补DNA(cDNA)第一链合成试剂盒将血浆RNA和各组血管内皮细胞总RNA逆转录合成cDNA。miR-34a正向引物:5′-CACGAAAGATGAAATACGCGCGC -3′;反向引物:5′-ATGGAGCCTGGGACGTGACCAT -3′;miR-145正向引物:5′-TAAA CGCACAGTAGGAACGATCCAG-3′;反向引物:5′-TAAGCACTTCGCAAGGA TTCGTTCGA -3′;SIRT1正向引物:5′-GGACGATAGGACCTAGTTTTCGG-3′,反向引物:5′-CGGAAGCACTGGTATTCCGGACA-3′;IGF-1R正向引物:5′-GAT TCTGTGACGGTCCCGAGTAG-3′,反向引物:5′-TGAGGTGCTGTGCGTGATGA CGC -3′;β-actin正向引物:5′-AGGGCCCATGAAATTCCGGGC-3′,反向引物:5′-ACATGCATGAAATTCCGGGCG-3′。聚合酶链式反应(PCR)体系20 μL,包括Premix Ex TaqⅡ 10 μL,正向引物1 μL,反向引物1 μL,模板DNA 4 μL,双蒸馏水4 μL。扩增条件:95 ℃预变性15 s,95 ℃变性10 s,60 ℃复性30 s,共40个循环。检测目标基因相对表达量。

1.4.5 蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测蛋白水平 收集各组血管内皮细胞,使用高效组织细胞快速裂解液提取总蛋白,蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度,取其中5 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳,将分离得到的蛋白湿法转膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,加入封闭用脱脂奶粉,室温下静置2 h。洗膜后向正常对照组、IL-6组、空载体转染组、miR-34a低表达组、miR-34a高表达组中加入鼠抗人SIRT1单克隆抗体,1∶500稀释;鼠抗人β-actin单克隆抗体,1∶1 000稀释,4 ℃过夜,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记二抗,1∶2 000稀释。向正常对照组、ox-LDL组、空载体转染组、miR-145低表达组、miR-145高表达组中加入鼠抗人胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)单克隆抗体,1∶1 000稀释;鼠抗人β-actin单克隆抗体,1∶1 000稀释,4 ℃过夜,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记二抗,1∶2 000稀释。上述各组均室温摇床孵育2 h,化学发光法成像,使用Image进行灰度分析。

2 结 果

2.1 两组miR-34a、miR-145水平比较 冠心病组miR-34a表达水平明显高于对照组,miR-145表达水平明显低于对照组,差异均有统计学意义(P<0.01)。详见表1。

表1 两组miR-34a、miR-145相对表达量比较(±s)

2.2 不同冠状动脉病变程度冠心病病人miR-34a、miR-145水平比较 重度组miR-34a水平明显高于中度组、轻度组,miR-145水平明显低于中度组、轻度组;中度组miR-34a水平明显高于轻度组,miR-145水平明显低于轻度组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 不同冠状动脉病变程度冠心病病人miR-34a、miR-145相对表达量比较(±s)

2.3 冠心病病人miR-34a、miR-145水平与Gensini评分的相关分析 Pearson相关分析显示,miR-34a水平与Gensini评分呈正相关(r=0.7529,P<0.001);miR-145水平与Gensini评分呈负相关(r=-0.750 1,P<0.001)。详见图1、图2。

图1 冠心病病人miR-34a水平与Gensini评分的相关性

图2 冠心病病人miR-145水平与Gensini评分的相关性

表3 冠心病病人心血管不良事件发生情况与miR-34a、miR-145相对表达量的关系(±s)

2.5 miR-34a对血管内皮细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达水平的影响 IL-6组、空载体转染组血管内皮细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达水平明显低于正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-34a低表达组SIRT1 mRNA及蛋白表达水平明显高于IL-6组、空载体转染组;miR-34a高表达组SIRT1 mRNA及蛋白表达水平明显低于IL-6组、空载体转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图3、表4。

图3 各组血管内皮细胞SIRT1蛋白表达的Western Blot电泳图

表4 各组血管内皮细胞SIRT1 mRNA及蛋白表达水平比较(±s)

2.6 miR-145对血管内皮细胞IGF-1R mRNA及蛋白表达水平的影响 ox-LDL组、空载体转染组血管内皮细胞IGF-1R mRNA及蛋白表达水平明显高于正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);miR-145低表达组IGF-1R mRNA及蛋白表达水平明显低于ox-LDL组、空载体转染组;miR-145高表达组IGF-1R mRNA及蛋白表达水平明显高于ox-LDL组、空载体转染组,差异均有统计学意义(P<0.05)。详见图4、表5。

图4 各组血管内皮细胞IGF-1R蛋白表达的Western Blot电泳图

表5 各组血管内皮细胞IGF-1R mRNA及蛋白表达水平比较(±s)

3 讨 论

miRNAs是广泛存在于自然界中的内源性高保守非编码单链RNA,能够与信使RNA的碱基互补配对后介导RNA的转录过程,进而发挥靶蛋白调控作用[9]。心血管疾病中miRNAs表达异常参与了内皮功能及巨噬细胞功能变化、血管平滑肌细胞过度增殖等病理过程[10]。miRNAs性质稳定,在人体内、外环境中均可稳定存在,能够作为冠心病、缺血性脑卒中等心脑血管疾病的标志物[11]。本研究结果显示,冠心病组miR-34a表达水平明显高于对照组,miR-145表达水平明显低于对照组(P<0.05),提示miR-145、miR-34a可能参与了冠状动脉粥样硬化的发生与发展,且随着冠心病病人冠状动脉病变程度的增加,miR-145表达水平逐渐下降,miR-34a表达水平逐渐升高,且miR-145表达水平与Gensini评分呈负相关,miR-34a表达与Gensini评分呈正相关。基础研究报道亦显示,miR-145在小鼠冠状动脉不稳定斑块中的表达水平明显降低,推测miR-145表达水平可能与硬化斑块的稳定性密切相关[12]。高脂饲料喂养的动脉粥样硬化模型小鼠大动脉miR-34a表达水平明显升高。提示血浆miR-34a、miR-145水平变化可用于冠状动脉病变严重程度的评估[13]。

血管内皮细胞是血管平滑肌与外周血液循环之间的屏障,同时也具有一定的分泌功能[14];血管内皮功能异常是动脉粥样硬化发生与发展的主要因素,其中炎症反应异常是主要机制[15]。SIRT1分布于哺乳动物细胞核,在成熟组织中广泛表达,SIRT1作为炎症反应的抑制因子,当表达降低时会促进促炎因子IL-6、细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1的生成,促进内皮细胞炎症反应[16]。本研究结果显示,使用IL-6处理血管内皮细胞后,细胞中SIRT1 mRNA及蛋白表达水平明显降低,下调miR-34a表达能够有效逆转该过程,使得SIRT1 mRNA及蛋白表达水平明显升高,miR-34a高表达可能通过降低SIRT1表达水平,促进内皮细胞炎症反应,加重冠状动脉粥样硬化程度。

IGF-1是一种多肽类激素,参与调控人体细胞的增殖、分化和凋亡等过程[17]。肝脏是IGF-1的主要合成器官,能够通过与细胞表面的IGF-1R特异性结合后发挥相应的生物学作用[18]。相关研究显示,IGF-1能够与内皮细胞表面的IGF-1R结合,提高内皮型一氧化氮合酶的活性,促进一氧化氮的释放[19]。一氧化氮通过清除氧自由基、扩张血管、促进钾离子通道开放等作用,促进内皮修复,抑制冠状动脉粥样硬化的发生与发展[20]。本研究使用ox-LDL刺激内皮细胞,细胞中IGF-1R mRNA及蛋白表达水平明显升高,可能与内皮细胞对高脂性损伤的自我保护机制有关,高脂损伤的内皮细胞通过提升IGF-1表达,分泌并释放更多的一氧化氮,抑制冠状动脉粥样硬化的进展。miR-145低表达能够明显抑制IGF-1 mRNA及蛋白表达水平,阻碍了受损的内皮细胞修复,进而促进冠状动脉粥样硬化的进展[21]。

综上所述,冠心病病人血浆miR-34a表达水平与冠状动脉病变程度呈正相关,miR-145表达水平与冠状动脉病变程度呈负相关。miR-34a高表达可能通过降低内皮细胞中SIRT1表达水平,减弱了SIRT1炎症抑制作用,进而促进内皮细胞炎症反应,加重冠状动脉粥样硬化程度;miR-145低表达可能通过降低内皮细胞中IGF-1表达水平,减弱了IGF-1促进一氧化氮分泌的作用,加剧高脂性损伤对冠状动脉粥样硬化的影响。