LC-MS/MS定量分析小鼠肝组织15种胆汁酸成分研究*

蔡玉莹,殷继明,宁琪琪,高玉雪,杨鹏翔,陈德喜

胆汁酸(bile acids,BAs)是一类二十四碳胆烷酸羟基衍生物的总称,在胆固醇稳态、脂质吸收和肠道信号传导过程中发挥重要作用[1,2]。肝脏中合成的主要BAs是胆酸(cholic acid,CA)和鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid,CDCA)[3]。在肠肝循环过程中,一部分初级BAs被微生物菌群转化为次级BAs,如脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)、石胆酸(lithocholic acid,LCA)和熊去氧胆酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)[4-7]。目前,检测BAs的方法有酶法[8-11]、薄层色谱法(thin-layerchromatography,TLC)[12-14]、气相色谱-质谱联用法(gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)[15]、高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)[16,17]和液相色谱-质谱联用法(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)等[18]。本研究建立了一种快速灵敏的LC-MS/MS法,无需衍生化,分析速度快,高通量,可以同时测定小鼠肝组织15种BAs,为科研提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与动物 Agilent 6495三重四极杆质谱仪系统、Agilent 1290 型超高效液相色谱仪系统 (美国 Agilent公司);BSA224S 型微量电子天平(德国 Sartorius公司);MS3 Digital 型涡旋混匀仪(德国 IKA公司);Centrifuge 5424R 型高速离心机(德国 Eppendorf公司);高速低温组织研磨仪(中国武汉塞维尔生物科技有限公司)。Milli-Q Advantage 纯水仪(美国 Millipore公司)制备超纯水(18.2 MΩ·cm);CA、DCA、CDCA、UDCA、LCA、甘氨去氧胆酸(glycodeoxycholic Acid,GDCA)、甘氨鹅去氧胆酸(glycochenodeoxycholic Acid, GCDCA)、甘氨熊去氧胆酸(glycoursodeoxycholic Acid, GUDCA)、牛磺胆酸(taurocholate Acid,TCA)、牛磺去氧胆酸(taurodeoxycholic Acid,TDCA)、牛磺鹅去氧胆酸(taurochenodeoxycholic Acid,TCDCA)、牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic Acid,TUDCA)、牛磺石胆酸(taurolithocholic Acid,TLCA) 标准品及三个稳定同位素标记的内标物质 (internal standard,IS) 石胆酸-d4(lithocholic acid-d4,LCA- d4)、甘氨熊脱氧胆酸-d5(glycoursodeoxycholic Acid- d5,GUDCA-d5)、2H4-脱氧胆酸(2H4-deoxycholic acid,2H4-DCA)(中国 上海安谱实验科技有限公司);甘氨胆酸(glycocholic Acid,GCA)、甘氨石胆酸(glycolithocholic acid,GLCA)购自加拿大 TRC公司。甲醇、乙腈(色谱纯,Thermo Fisher公司),醋酸盐(美国 Sigma-Aldrich公司),活性炭(美国 Sigma-Aldrich公司)。雄性SPF级C57BL/6小鼠,5～9周龄,体质量为24～32 g,由北京维通达生物技术有限公司提供。严格遵守首都医科大学动物伦理和福利相关规定(伦理批件号:AEEI-2021-257) 进行动物实验。

1.2 标准溶液的配制 称取标准品,用甲醇溶解配制成质量浓度均为 1 mg/mL单标储备液。以不同比例准确移取各标准品溶液,制成混合标准溶液。用甲醇稀释配制成11个浓度梯度标准溶液以及低、中、高三个浓度质控溶液,其中CA、DCA、CDCA、UDCA、TCA、TDCA、TCDCA、TUDCA浓度为3.9 ng/mL～4 μg/mL,质控浓度分别为40 ng/mL、400 ng/mL、3 μg/mL; GCA、GDCA、GCDCA、GUDCA浓度为1.95 ng/mL～2 μg/mL,质控浓度分别为20 ng/mL、200 ng/mL、1.5 μg/mL;LCA、GLCA、TLCA浓度为0.98 ng/mL～1 μg/mL,质控浓度分别为10 ng/mL、100 ng/mL和1 μg/mL。IS浓度为1 μg/mL。

1.3 色谱条件 色谱柱:Agilent Poroshell 120 EC C18色谱柱(100 mm×4.6 mm,2.7 μm),流动A相为5 mmol/L醋酸铵水溶液,B相为乙腈/甲醇比例为3比2的混合溶液;梯度洗脱程序:起始40%B,0～2 min 40%B;2～8 min 60%B;8～10 min 95%B;10～13 min 95%B维持;13～15 min 40%B。流速为0.3 mL/min,柱温30℃,自动进样器温度4℃,进样器体积为2 μL。

1.4 质谱条件 采用Agilent 6495三重四极杆质谱系统和电喷雾电离 (electron spray ionization,ESI)负离子模式,多重反应监测(multiple reaction monitoring,MRM),Nebuilzer 20 psi,Gas Flow 14 L/min,Sheath Gas Temp 250℃, sheath gas flow 11 L/min,capillary 3000 V,nozzle voltage 1500 V。

1.5 肝组织BAs检测 精密称取肝组织90 mg,加去离子水500 μL,加研磨珠匀浆。将肝组织以60 HZ匀浆10 min,取50 μL匀浆液加入-20℃预冷的碱性乙腈(5% NH4OH)250 μL,加入IS (1 μg/mL2H4-DCA,1 μg/mLGUDCA-d5,1 μg/mL LCA-d4)10 μL,涡旋30 min,15000 r/m离心10 min。吸取上清液100 μL,加入内插管中,注入LC-MS/MS系统进行分析。

1.6 空白基质处理 称取3只普通小鼠肝组织90 mg,加去离子水500 μL匀浆。加入活性炭(100 mg/mL)500 μL孵育30 min,去除基质中的内源性BAs。将混合物在16000 g下离心10 min,取出上清液600 μL,过滤,在16000 g离心1 min。去除基质滤液,以构建肝脏生物基质的标准曲线。

2 结果

2.1 质谱条件的优化情况 采用1 μg/mL的单标准品溶液,流速为0.30 mL/min,对15种BAs质谱参数进行优化。应用ESI源,在MRM模式下对标准品及其IS的母离子、子离子和碰撞能量进行逐一优化。结果表明,在ESI负离子模式下,15种BAs和3种IS都可以获得强度较高的[M-H]-准分子离子峰,在二级质谱高碰撞能量下获得丰度较高的子离子。对于游离BAs,使用母离子定量,对甘氨结合型胆汁酸(glycine-conjugated bile acids,G-BAs)以73.9 m/z (NHCH2COOH-)为子离子,对牛磺结合型胆汁酸(taurine-conjugated bile acids,T-BAs)以79.8 m/z(SO3-)为子离子。继续优化碰撞能量,使目标化合物具有最高的灵敏度。

2.2 色谱条件的优化情况 本实验结果发现,流动A相为5 mmol/L醋酸铵水溶液,B相为乙腈甲醇(3∶2)的混合溶液,采用梯度洗脱时,能够很好地分离各类BAs,且各物质峰形良好,具有较高的灵敏度(图1)。醋酸铵的加入极大地提高了离子响应,将分析时间缩短到15 min,能够快速高效地分析15种BAs,确保母离子和子离子都相同的BAs能实现基线分离,达到很好的定量分析效果。

图1 15种BAs的色谱图横坐标为采集时间,纵坐标为counts(%),15种BAs的峰型良好游离BAs (以红色显示),其中1:CA;2:DCA;3:CDCA;4:UDCA;5:LCAG-BAs(以蓝色显示),其中6:GCA;7:GDCA;8:GCDCA;9:GUDCA;10:GLCAT-BAs (以黑色显示),其中11:TCA;12:TDCA;13:TCDCA;14:UDCA;15:TLCA

2.3 样本前处理的优化 BAs属于内源性物质,无法直接从小鼠肝组织提取以作为空白基质。采用模拟空白基质与实际背景相差较大,造成检测误差。因此,在本研究,采用活性炭吸附法去除小鼠肝组织内源性BAs的干扰,以获得较为准确的空白基质。预实验结果表明吸附后的肝组织匀浆溶液均无各类BAs检出。在已发表的研究,对肝组织前处理一般使用SPE固相萃取等方法,但这种方法耗时长、成本高,不适用于大批量样本检测。本实验采用蛋白沉淀法,样本经碱性乙腈处理后离心沉淀,简化了前处理过程,提高了检测效率。

2.4 标准曲线和检出限的确定 以活性炭处理后的空白基质为背景,加入15个BAs和3个IS,在适当范围构建11个校准点的标准曲线。以分析物与IS的峰面积比为纵坐标,各标准品浓度为横坐标作标准曲线,通过调整最佳加权因子1/X或1/X2(X是每种分析物的浓度) 分析校准。结果表明,15种BAs线性良好,R2均大于0.993。以信噪比S/N=3∶1时对应的浓度确定本方法的检出限( limit of detection,LOD),LOD均小于2ng/mL。

2.5 精密度、准确度和基质效应情况 取空白肝组织匀浆液和各BAs标准品溶液,制备15种BAs低、中、高浓度质控样本,每一浓度平行操作6份,1天内进样6次,以获得日内检测结果,3日重复进样,获得日间检测结果,并代入线性回归方程,计算浓度。准确度计算方法为:准确度(RE)=测算值-真实值/真实值×100%;精密度计算方法为:相对标准偏差(RSD)=标准偏差(SD)/计算结果的算术平均值(X)×100%。在本方法中,15种BAs在低、中、高 QC样本浓度下日内 RE 为-13.18 %～10.95 % ,日内 RSD 为 0.92%～11.74%;日间 RE 为-11.27%～8.58% ,日间 RSD 为2.07%～11.33%。通过比较在甲醇标准溶液和空白基质溶液中,以15种BAs低、中、高 QC样本的比值来确定基质效应。在本方法中,基质效应值为90.76%～109.25%。测定结果表明,小鼠肝组织BAs分析的准确度、精密度和基质效应良好。

2.6 稳定性 取空白肝组织匀浆液和各BAs标准品溶液,制备15种BAs低、中、高浓度各6份标本,分别置于自动进样器4℃24 h,反复冻融3次,-80℃冷冻保存1个月,测定结果显示在自动进样器4℃存放24 h时,RE为-12.67%～7.74%, RSD为0.71%～13.28%;反复冻融3次,RE为-13.98%～10.75%,RSD为0.67%～15.53%;-80℃冷冻保存1个月,RE为-13.89%～12.89%,RSD为0.62%～15.32%。在以上三种测定条件下,样品较稳定,未见明显降解,表明在这些条件下样本均能保持稳定。

2.7 肝组织BAs测定 应用上述所建立的方法测定6例小鼠肝组织15种BAs含量,游离BAs主要以初级BAs的CA和CDCA为主, 次级BAs 的DCA和LCA含量较低(图2A);G-BAs以GCA为主,甘氨酸结合型浓度较低,在线性范围内检测不到GCDCA和GUDCA(图2B);小鼠肝组织T-BAs主要以TCA和TDCA为主(图2C);游离BAs 浓度[(723.89±50.65)ng/mL],显著高于G-BAs[(56.90±11.28)ng/mL,P<0.001];T-BAs浓度[(40322.90±14034.80)ng/mL]显著高于游离BAs[(723.89±50.65)ng/mL,P<0.001],也显著高于G-BAs[(56.90±11.28)ng/mL,P<0.001,图2D],提示小鼠肝组织BAs代谢水平的差异性和复杂性,值得深入研究。

图2 LC-MS/MS检测6例小鼠肝组织BAs浓度A:各游离BAs浓度; B:各G-BAs浓度; C:各T-BAs浓度;D:游离BAs、G-BAs和T-BAs浓度游离BAs与G-BAs相比, ***P<0.001;游离BAs与T-BAs相比, ***P<0.001;G-BAs与T-BAs相比,***P<0.001

3 讨论

本研究基于靶向LC-MS/MS技术建立了检测小鼠肝组织15种BAs含量的检测方法,并进行了方法学验证。使用Agilent Poroshell 120 EC C18色谱柱,ESI离子源,流动相中醋酸铵的加入,在负离子MRM模式下提高了离子化效率,改善了峰形。而过高的醋酸铵则会抑制BAs的离子化,前期实验表明5 mmol/L醋酸铵离子化效果最佳。

BAs属于小鼠肝脏的内源性物质,无法直接获取空白基质。本实验中通过活性炭吸附,有效去除内源性BAs,最大程度降低对检测结果的影响,使准确性显著提高。采用乙腈蛋白沉淀的前处理方法,仅需50 μL样本,操作简单快速,背景干净,基质效应良好。实验结果表明,15种BAs在其线性浓度范围内线性相关系数 R2均大于0.993,LOD均小于2 ng/mL,基质效应范围为90.76%～109.25%。准确度、精密度和稳定性均满足生物样本分析要求。检测小鼠肝组织BAs,结果TCA和TDCA浓度较高。

准确定量BAs亚型浓度对进一步研究肝脏疾病具有重要意义。本研究采用LC-MS/MS检测了小鼠肝组织15种BAs含量,结果显示游离BAs中的初级BAs CA和CDCA浓度分别是对应次级BAs DCA和LCA的22倍和31 倍,且初级BAs中CA是CDCA的1.25倍,符合BAs的合成过程。游离型BAs和结合型BAs(G-BAs、T-BAs)都以母体CA为主,其中TCA浓度最高,是CA的115倍或GCA的683倍。6例样本的BAs含量存在一定的差异,尤其是T-BAs,除小鼠个体差异外,还可能是采集时胆汁的污染造成的。T-BAs是小鼠的主要BAs,符合已有研究结果,与人类或大鼠不同。在小鼠,负责BAs与氨基酸结合的酶对牛磺酸具有更强的亲和力。