子痫前期患者的胎盘环状RNA表达谱及与病情的相关性

韩贞艳，关红琼

子痫前期是妊娠20 周后发生的以高血压和蛋白尿为特征的一种妊娠特异性疾病，伴有高血压和多器官功能障碍［1-2］。目前，子痫前期的发病机制尚未完全阐明，可能与母体、胎儿及胎盘等因素相关［3］。子痫前期的诊断、病情评估及治疗对预防子痫及由其引起的靶器官损伤具有重要意义，但目前子痫前期尚无有效的预测、评估指标。环状RNA（circRNA）是内源性非编码RNA 的新成员，参与细胞分化、增殖及凋亡等多种生物过程，与细胞生长、血管生成等过程有关［4］，具有稳定、普遍及特异性等优势［3，5］。筛选与正常人差异表达的circRNA有助于筛查具有子痫前期风险的患者，有望成为子痫前期的潜在标志物［6］。本研究对子痫前期患者胎盘circRNA 水平及胎盘功能相关指标，如STOX1（storkhead box 1）蛋白、血清可溶性血管内皮生长因子受体1（soluble fms-like tyrosine kinase 1，sFlt-1）及其他临床特征进行相关性分析，以便能早期诊断，及时干预，改善预后，降低患者死亡风险。

1 对象与方法

1.1 研究对象及分组 选取2020年10月—2021年8月于海南医学院第二附属医院诊治的子痫前期或重度子痫前期患者。纳入标准：（1）符合子痫前期或重度子痫前期诊断标准［7］。（2）孕妇为自然受孕。（3）单胎妊娠。（4）临床资料完整。排除标准：（1）合并其他妊娠期疾病者。（2）合并心、脑、肾等脏器严重损伤者。（3）合并严重血液系统疾病及自身免疫系统疾病者。（4）合并恶性肿瘤者。（5）合并严重精神-神经系统疾病不能配合者。最终纳入子痫前期患者（子痫前期组）15例，重度子痫前期患者（重度子痫前期组）25例。选取同期于我院行常规产检的正常妊娠女性30 例为对照组。3 组孕产妇年龄18~40 岁。本研究通过我院伦理委员会审核并批准（K20200922208），所有患者均对本研究知情，并签署知情同意书。

1.2 观察指标 一般资料：收集患者年龄、孕次、产次、入组时孕周及体质量指数（BMI）。于纳入次日清晨测量收缩压及舒张压，并计算平均动脉压，平均动脉压=（收缩压+2×舒张压）/3。收集患者24 h 尿液，应用双缩脲法进行24 h 尿蛋白定量检测。抽取患者空腹静脉晨血5 mL，置于无抗凝剂的试管中，静置1 h，在4 ℃下以3 000 r/min离心10 min，收集血清，置于-80 ℃的冰箱中保存备用，采用酶联免疫吸附试验（ELISA），于全自动酶免工作站（博科BIOBASE4000）上检测血清中的STOX1 蛋白、sFlt-1、胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）及血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）水平，试剂盒均购自深圳晶美生物有限公司，操作过程严格按照产品说明书进行。

1.3 RNA提取 于胎盘娩出后1 min内收集胎盘组织标本，在无菌条件下从胎盘母体面中央切取数块胎盘组织（大小约1 cm3），避开钙化斑，用生理盐水冲洗3 次，放入冻存管中迅速置于液氮罐中低温保存，用于胎盘circRNA 的检测。根据NEBNext®UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit 试剂盒［美国纽英伦生物技术（北京）有限公司］说明书使用RNAiso Plus试剂进行总RNA 的分离和纯化。使用超微量分光光度计进行RNA 纯度的检测。采用Qubit 2.0 荧光计中的Qubit RNA检测试剂盒检测RNA。使用Agilent 生物分析仪（安捷伦2100，美国）的RNA Nano 6000 检测试剂盒对胎盘中RNA 的完整性进一步评估，确保研究中RNA的质量。

1.4 RNA 的建库和测序 使用Epicenter Ribo-zeroTMrRNA试剂盒（Epicentre，美国）去除核糖体RNA以后，建立circRNA文库用于分析circRNA。按照NEBNext®UltraTMDirectional RNA Library Prep Kit试剂盒说明书，使用NEBNext®UltraTM定向RNA文库准备试剂盒［美国纽英伦生物技术（北京）有限公司］建立文库，使用TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS（Illumia）在a cBot Cluster Generation System 上对编码后的样本进行聚类。随后在Illumina HiSeq 4000 平台（Illumina，美国）上对circRNA使用PE150（双端测序）测序策略进行测序。

1.5 原始测序数据质量控制 移除原始测序数据中包含接头、ploy-N 和低质量的原始数据之后得到清洗后的高质量circRNA 数据，计算清洗后数据中Q20、Q30 和GC 含量，后续均应用高质量测序数据进行分析。

1.6 差异表达分析 分别获取各组经处理后的高质量数据进行差异基因筛选，使用DESeq R package（1.10.1）根据差异倍数和显著性水平进行筛选，差异表达circRNA 的筛选条件均为P＜0.05。使用R 统计软件中的pheatmap 包，根据所有差异表达circRNA 标准值进行层次聚类分析，对于circRNA以每百万转录本（Transcripts Per Million，TPM）值为表达水平，以log10（TPM+1）值进行绘图及聚类分析，选取上调及下调基因各自差异表达水平由高到低排名前3 位的基因进行分析。

1.7 统计学方法 所有数据均采用R（4.0.6）软件进行数据分析，计量资料以±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验；计数资料以例（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson法；采用多元线性回归模型分析影响孕妇24 h 尿蛋白定量的相关因素，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 孕妇一般资料比较 3组孕妇的年龄、孕次、产次及孕周差异无统计学意义；与对照组比较，子痫前期组及重度子痫前期组的BMI 和平均动脉压升高（P＜0.05）；与子痫前期组比较，重度子痫前期组BMI 差异无统计学意义，平均动脉压升高（P＜0.05），见表1。

2.2 孕妇实验室指标比较 对照组、子痫前期组及重度子痫前期组24 h 尿蛋白定量、STOX1 及sFlt-1水平依次升高，VEGF 及PLGF 水平依次降低（P＜0.05），见表2。

2.3 孕妇胎盘circRNA 表达情况 对照组、子痫前期组及重度子痫前期组胎盘hsa_circ_0014736、hsa_circ_0015383及hsa_circ_0004904表达水平依次升 高，而hsa_circ_0063517、hsa_circ_0007121 及hsa_circ_0003171 表达水平依次降低（P＜0.05），见图1、表3。

2.4 孕妇胎盘circRNA表达水平与临床特征的相关性 相关性分析显示，子痫前期组及重度子痫前期组hsa_circ_0014736、hsa_circ_0015383 及hsa_circ_0004904 分 别 与BMI（r=0.366、0.285、0.270，P＜0.05）、平均动脉压（r=0.604、0.463、0.288，P＜0.05）、24 h 尿蛋白定量（r=0.791、0.817、0.607，P＜0.05）、STOX1（r=0.410、0.411、0.434，P＜0.05）、sFlt-1（r=0.296、0.323、0.302，P＜0.05）呈正相关，与VEGF（r=-0.554、-0.551、-0.384，P＜0.05）、PLGF（r=-0.400、-0.224、-0.406，P＜0.05）呈负相关；子痫前期组及重度子痫前期组hsa_circ_0063517、hsa_circ_0007121及hsa_circ_0003171 分别与BMI（r=-0.257、-0.316、-0.269，P＜0.05）、平均动脉压（r=-0.544、-0.619、-0.481，P＜0.05）、24 h尿蛋白定量（r=-0.682、-0.834、-0.633，P＜0.05）、STOX1（r=-0.366、-0.467、-0.254，P＜0.05）、sFlt-1（r=-0.409、-0.400、-0.374，P＜0.05）呈 负 相 关，与VEGF（r=0.376、0.660、0.347，P＜0.05）、PLGF（r=0.440、0.262、0.225，P＜0.05）呈正相关。

Fig.1 Relative expression levels of placental circRNA in pregnant women图1 孕妇胎盘circRNA相对表达水平

Tab.1 Comparison of general data between the three groups表1 各组一般资料比较

Tab.2 Comparison of laboratory indicators between the three groups表2 各组实验室指标比较 （±s）

Tab.2 Comparison of laboratory indicators between the three groups表2 各组实验室指标比较 （±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与子痫前期组比较，P＜0.05。

组别对照组子痫前期组重度子痫前期组F n 30 15 25 24 h尿蛋白定量（g）0.09±0.01 1.28±0.33a 4.43±1.21ab 241.269＊＊STOX1（ng/L）40.67±5.13 44.39±6.28a 49.41±7.39ab 13.298＊＊sFlt-1（ng/L）203.54±65.28 255.82±71.34a 298.42±79.48ab 11.966＊＊VEGF（ng/L）232.73±25.76 187.12±20.89a 151.37±18.26ab 91.537＊＊PLGF（pg/L）511.23±79.21 461.54±62.79a 413.64±53.02ab 14.319＊＊

Tab.3 Comparison of placental circRNA expression between the three groups表3 各组胎盘circRNA表达情况比较 （±s）

Tab.3 Comparison of placental circRNA expression between the three groups表3 各组胎盘circRNA表达情况比较 （±s）

＊＊P＜0.01；a与对照组比较，b与子痫前期组比较，P＜0.05。

组别对照组子痫前期组重度子痫前期组F n 30 15 25 hsa_circ_0014736 0.81±0.15 1.13±0.17a 1.53±0.19ab 123.127＊＊hsa_circ_0015383 0.83±0.17 1.02±0.19a 1.48±0.23ab 75.541＊＊hsa_circ_0004904 0.87±0.23 1.12±0.27a 1.33±0.34ab 18.263＊＊hsa_circ_0063517 1.07±0.23 0.87±0.16a 0.72±0.11ab 25.938＊＊hsa_circ_0007121 1.21±0.19 0.76±0.15a 0.43±0.12ab 164.876＊＊hsa_circ_0003171 1.19±0.23 1.01±0.18a 0.89±0.17ab 15.614＊＊

2.5 影响孕妇24 h 尿蛋白定量的多元线性回归分析 hsa_circ_0015383 与孕妇24 h 尿蛋白定量呈正向线性相关，hsa_circ_0063517 及hsa_circ_0007121与孕妇24 h尿蛋白定量呈负向线性相关（P＜0.05），见表4。

Tab.4 Linear regression analysis of relevant indexes affecting 24 h quantitative urine protein of eclampsia pregnant women表4 影响子痫孕妇24 h尿蛋白定量相关指标的线性回归分析

3 讨论

目前，子痫前期的病因尚未明确，胎盘功能障碍是目前学者认为子痫前期的主要潜在病因，但具体机制仍需进一步研究［8］。circRNA 参与调控转录及转录后的基因表达，稳定性良好。研究显示环状RNA牛痘相关激酶1（circVRK1）可抑制滋养层细胞迁移、侵袭及上皮间质转化，提示circRNA 在子痫的发生发展中发挥重要作用，并可能成为子痫前期的诊断及 干 预 靶 点［9］。陈 维 等［10］研 究 显 示，hg38_circ_0014736 及hsa_circ_0015382 在子痫前期患者胎盘组织中高表达。高明明等［9］发现hsa_circ_0005579在子痫前期患者胎盘中高表达。基于此，笔者对我院诊治的子痫前期患者进行研究，旨在对子痫前期的病情预测提供新思路。

本研究结果显示，hsa_circ_0007121、hsa_circ_0063517 水平下调及hsa_circ_0015383 水平上调与子痫前期的发生、发展密切相关。circRNA 可作为竞争性内源RNA（ceRNA）发挥作用，并与多种miRNA相结合，调节下游基因表达［11］。当miR-182-5p过表达时，人绒毛膜滋养层细胞的增殖、迁移、侵袭受到抑制，导致滋养层细胞凋亡、死亡，hsa_circ_0007121 可 与miR-182-5p 结 合，降 低miR-182-5p水平，若hsa_circ_0007121 下调，与miR-182-5p 结合减少，miR-182-5p 水平升高，表明hsa_circ_0007121 可通过调节miR-182-5p 影响子痫前期的发生发展［12］。hsa_circ_0063517 则与miR-31-5p 的表达相关，hsa_circ_0063517可充当miR-31-5p的海绵分子，起到调节B型内皮素受体表达的作用，子痫前期患者体内hsa_circ_0063517 表达水平下调，miR-31-5p 水平明显升高，抑制miR-31-5p 表达或上调hsa_circ_0063517 表达水平可促进血管内皮细胞生长、迁移及血管生成，而抑制hsa_circ_0063517表达则可抑制B 型内皮素受体的表达［13］，与本研究结果一致，提示hsa_circ_0063517可通过促进B型内皮素受体表达而起到促进血管生成的作用，从而参与子痫前期的发生、发展。hsa_circ_0015383 位于chr1染色体，最可能靶向结合的miRNA 反应元件为hsa-miR-197。hsa-miR-197为一种抑癌因子，与肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡密切相关［14］，故hsa_circ_0015383可能通过与hsa-miR-197靶向结合，影响滋养层细胞增殖、侵袭及凋亡等过程，从而参与子痫前期的发生、发展。此外，研究显示hsa_circ_0015383/miRNA/mRNA 可能与Wnt 信号通路及Notch 信号通路相关［15］。而Wnt/β 连环蛋白通路受抑，可能会使滋养层细胞侵袭能力降低，导致胎盘着床过浅，此外，非经典Wnt通路可使蜕膜化异常，进而诱发子痫前期［16］。

STOX1 及sFlt-1 为胎盘功能相关指标，STOX1水平升高可使子痫前期小鼠的血管内皮功能发生障碍，引起子宫螺旋动脉重塑，而sFlt-1能抑制胎盘血管生成，两者与子痫前期的发生、发展密切相关［17］。VEGF 为糖蛋白二聚体，起源于血管内皮细胞，具有促微血管生成、维持细胞稳态及调控胎盘血管生成等生理作用；PLGF 为VEGF 家族一员，主要在胎盘高表达，可与VEGF协调合作，共同促进胎盘血管生成及发育［18］。通过进一步对影响子痫前期患者病情的因素进行相关性分析，结果显示hsa_circ_0014736、hsa_circ_0015383及hsa_circ_0004904水平与sFlt-1、STOX1呈正相关，与VEGF和PLGF呈负相关，即上述3 种circRNA 表达水平越高，sFlt-1、STOX1水平越高，血管内皮功能发生障碍越严重，胎盘血管发育不良，患子痫前期的风险越高，VEGF 和PLGF 作为胎盘发育的有利因素，可促进胎盘发育，而VEGF 和PLGF 水平降低，可使胎盘血管发育不良，诱发子痫前期。hsa_circ_0063517、hsa_circ_0007121 及hsa_circ_0003171 表达情况则与此相反。此外，对上述影响因素行多元线性回归分析，结果显示hsa_circ_0015383 与孕妇24 h 尿蛋白定量呈正向线性相关，hsa_circ_0063517 及hsa_circ_0007121 与孕妇24 h 尿蛋白定量呈负向线性相关，而STOX1、sFlt-1、VEGF 及PLGF 与孕妇24 h 尿蛋白定量无线性相关，可能与hsa_circ_0015383、hsa_circ_0063517及hsa_circ_0007121 等共线性有关。故circRNA 是否参与调控sFlt-1、STOX1 表达仍需进一步深入研究。

综上，hsa_circ_0007121、hsa_circ_0063517 水平下调及hsa_circ_0015383 水平上调在子痫前期的发生、发展中具有重要意义，可作为子痫前期病情监测及干预的新靶点。但本研究受样本量影响，结果具有一定局限性，且未探索下游蛋白，故应进一步行多中心、大样本的试验对其进一步分析。