益生菌的不同组合体外抗幽门螺杆菌作用的实验研究

管爱星,黄玉存,黄干荣,覃艳春,罗家锱,黄亮,黄衍强,黄赞松,5

(1. 右江民族医学院研究生学院,广西 百色 533000;2. 右江民族医学院基础医学院,广西 百色 533000;3. 广西病原微生物耐药防控科技创新合作基地,广西 百色 533000;4. 广西高校耐药微生物感染防治研究重点实验室,广西 百色 533000;5. 右江民族医学院附属医院消化内科,广西 百色 533000)

幽门螺杆菌(Helicobacterpylori,H.pylori)是存在于人胃当中的有害细菌,人群感染率约50%,是导致胃炎、胃溃疡等消化疾病的主要病原微生物[1],同时也是胃癌的高危因素[2]。感染它后可按Correa提出的炎癌转化模式(胃炎-萎缩-肠化生-癌前病变)导致胃癌的发生[3]。根除H.pylori能有效治疗胃炎、胃溃疡等消化道疾病,并且可以降低胃癌发病率、阻止癌前病变的进展[4]。根除H.pylori治疗方法主要是含抗生素的四联疗法[5],然而随着抗生素的使用,其产生的耐药逐渐升高,且指南推荐的10～14 d的抗生素治疗,会造成肠道菌群失调等不良反应[6- 7]。近年来发现,根除H.pylori时,添加益生菌能有效提高根除率、减轻肠道菌群失调等胃肠道不良反应[8]。有研究表明,益生菌及其代谢产物也具有一定的抗H.pylori效果[9-11],但具体的抑菌效果不明确,特别是联合抑菌的效果,什么组合抑菌最佳或者抑菌圈的直径是多少等不清楚。因此,本研究先检测单个益生菌的抑菌效果,再探讨不同组合的抑菌效果,以寻找最佳的组合方式。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药品及试剂 甲硝唑(上海麦克林生化科技股份有限公司)、阿莫西林(先声药业集团有限公司)、左氧氟沙星(扬子江药业集团有限公司)、克拉霉素(扬子江药业集团有限公司)、营养肉汤(杭州百思生物技术有限公司BS1002)、营养琼脂(杭州百思生物技术有限公司BS1101)、 MRS肉汤(青岛海博生物技术有限公司,货号HB0384-1)、MRS琼脂(青岛海博生物技术有限公司,货号HB0384-5)、Brain Heart infusion(BHI)培养基(OXOID,货号CM1135B)、Columbia blood Agar base(培养基(OXOID,lot2179850)、TPY琼脂(青岛海博生物技术有限公司,货号HB0397)、小牛血清[平睿生物科技(北京)有限公司]。

1.1.2菌株H.pylori标准菌株26695及H.pylori耐药菌株159、286由右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心提供;益生菌(枯草芽孢杆菌、弯曲乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、长双歧杆菌)来源于右江民族医学院耐药微生物感染防治研究中心。

1.1.3主要仪器 三气培养箱(Binder model CB16

0,Germany)、恒温震荡培养箱(上海智城分析仪器制造有限公司)、电热恒温培养箱(上海齐欣科学仪器有限公司)、多功能酶标仪(BioTek,America)、离心机(湘南湘仪有限公司)、紫外分光光度仪(HITACHI,Japan)、超低温冰箱(海尔DW-86L388A),电冰箱(海尔BCD-601WDPR)、生物安全柜(山东博科科学仪器有限公司)、生物显微镜(广州明美光电技术有限公司)、全立式高压灭菌器(GR60DP)、电热古风干燥箱(DHT-G1358)、精细天平(OHAUS)、移液枪(艾本德)等。

1.2方法

1.2.1配制培养基 称取MRS琼脂培养基33.1 g溶于500 mL蒸馏水中,营养琼脂16.5 g溶于500 mL蒸馏水中,高压灭菌锅121 ℃灭菌30 min,冷却至50 ℃倾倒100 mm平板; 称取哥伦比亚培养基13.3 g溶于270 mL蒸馏水中,高压灭菌锅121 ℃灭菌30 min,冷却至50 ℃,再加入占总体积10%的小牛血清,轻摇混匀后倾倒平板,4 ℃保存备用。

1.2.2细菌培养 从-80 ℃超低温冰箱取出H.pylori菌株,待其融化后离心,取沉淀涂于的哥伦比亚培养基上,置于三气培养箱(85%氮气、5%氧气、10%二氧化碳)37 ℃ 恒温培养3～4 d。从-80 ℃超低温冰箱取出弯曲乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、长双歧杆菌、枯草芽孢杆菌,待其自然融化,离心,取沉淀分别涂于MRS琼脂、哥伦比亚培养基、TPY固体培养基和营养琼脂培养基上,37 ℃恒温培养1～2 d。

1.2.3菌悬液的制备 取少许对数生长期的H.pylori菌落,加入含10%血清的BHI培养基中,1 mL移液器吹打混匀,三气培养箱内37 ℃震荡培养2～3 d,获得H.pylori菌悬液;取少许处于对数期的弯曲乳酸杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌、长双歧杆菌、枯草芽孢杆菌,分别放入MRS培养基、TPY培养基和营养肉汤中培养12～48 h,获得益生菌菌悬液。

1.2.4H.pylori药敏检测 将抗菌药物阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星分别配成1 mg/mL;将细菌96孔板第一孔先加培养基173.6 μL,再加6.4 μL抗菌药物,倍比稀释至第8孔;取已准备的H.pylori菌悬液,调整度OD600为0.3(1.0×108CFU/mL),稀释10倍,为1.0×107CFU/mL备用;再取稀释的菌悬液10 μL加至第1～8孔,同时设阳性和阴性对照孔,置于三气培养箱内培养72 h,以完全抑制细菌生长的最低药物浓度作为MIC,并根据中国抗生素应用指南,判定H.pylori对抗生素敏感(S)或耐药(R)。

1.2.5益生菌对H.pylori抑制实验

1.2.5.1H.pylori铺板 如1.2.4所述,将H.pylori菌悬液稀释为1.0×106CFU/mL;取100 μL加入含10%小牛血清的哥伦比亚培养基上,无菌接种环密涂,再置于三气培养箱内37 ℃培养3～4 h。

1.2.5.2单种益生菌抑制H.pylori将枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、弯曲乳杆菌、长双歧杆菌,分调整菌液浓度OD600为0.3(1.0×108CFU/mL),稀释1 000倍,为1.0×105CFU/mL,备用;分别取准备好的枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、嗜酸乳杆菌、弯曲乳杆菌、长双歧杆菌菌悬液2 μL,滴加于经过培养3～4 h后的哥伦比亚培养基上,小心平移,重新放入三气培养箱内,37 ℃共培养2～3 d。测量并记录益生菌对H.pylori的抑菌圈的直径。

1.2.5.3两种益生菌组合抑制H.pylori将备好的1.0×105CFU/mL枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、弯曲乳杆菌、嗜酸乳杆菌,以枯草芽孢杆菌+粪肠球菌、枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌+弯曲乳酸杆菌、粪肠球菌+弯曲乳杆菌、粪肠球菌+嗜酸乳杆菌、弯曲乳酸杆菌+嗜酸乳酸杆菌菌种的6种组合,并按20∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶20比例的菌量配成组合益生菌液,充分混匀成混悬液,取2 μL混悬液滴加于涂有H.pylori的哥伦比亚培养基上,小心平移,重新放入三气培养箱内,37 ℃培养2～3 d,测量并记录两种益生菌联合后对H.pylori的抑菌圈直径。

2 结果

2.1H.pylori菌株药敏检测结果 根据CLSI药敏实验标准(2022),H.pylori菌株26695为标准菌株,其对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星的药敏结果均敏感;菌株159、286为多重耐药菌株,对阿莫西林、克拉霉素、甲硝唑、左氧氟沙星中的两种及两种以上的抗生素耐药。见表1。

表1 H.pylori菌株对抗生素的MIC 单位:μg/mL

2.2单独使用益生菌对H.pylori的抗菌作用 检验单种的益生菌抑制H.pylori生长时,对于标准菌株26695,枯草芽孢杆菌的抑制效果最好,粪肠球菌次之(见表2、图1),嗜酸乳杆菌和弯曲乳杆菌的抑菌效果相当(P>0.05);对于耐药菌株(159和286),枯草芽孢杆菌的抑菌效果也是最佳(见表2、图1),嗜酸乳杆菌和弯曲乳杆菌的抑菌效果相当(P>0.05),长双歧杆菌和蜡样芽孢杆菌与H.pylori共培养时,未见其产生抑菌效果。

表2 益生菌单独对H.pylori的抑菌圈直径 单位:mm

HP26695标准株 HP286耐药株

2.3单独或者联合使用两种益生菌对H.pylori的抑菌效果 如图2所示,枯草芽孢杆菌+粪肠球菌1∶1混合比单独的枯草芽孢杆菌抑制H.pylori效果较好。如表3所示,枯草芽孢杆菌+粪肠球菌、枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌1∶1混合的抑制H.pylori效果较好。

注:A.枯草芽孢杆菌+粪肠球菌;B.粪肠球菌+弯曲

表3 联合益生菌对H.pylori的抑制作用

2.4不同比例的枯草芽孢杆菌+粪肠球菌联合抑制H.pylori效果 对于耐药菌株159、286,与枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=1∶1比较,枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=20∶1、枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=10∶1抑菌圈直径增大,差异有统计学意义(P<0.05)。与枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=1∶10比较,枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=20∶1、枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=10∶1抑菌圈直径增大,差异有统计学意义(P<0.05)。与枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=1∶20比较,枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=20∶1、枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=10∶1抑菌圈直径增大,差异有统计学意义(P<0.05)。但是枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=20∶1与枯草芽孢杆菌∶粪肠球菌=10∶1比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

表4 枯草芽孢杆菌+粪肠球菌不同比例对H.pylori的抑菌圈直径 (n=3,单位:mm)

2.5不同比例的枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌联合抑制H.pylori的效果 对于耐药菌株159、286,与枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶20比较,枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=20∶1、枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=10∶1、枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1的抑菌圈直径明显增大,差异有统计学意义(P<0.05),但是枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=20∶1、枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=10∶1、枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1之间的抑菌圈直径大小差异无统计学意义(P>0.05)。见表5、见图3。

表5 枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌对H.pylori抑菌圈直径 (n=3,单位:mm)

注:A.枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=20∶1;B.枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=10∶1;C.枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶1;D.枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=1∶10;E.枯草芽孢杆菌∶嗜酸乳杆菌=20∶1;F.枯草芽孢杆菌;G.嗜酸乳杆菌。

3 讨论

H.pylori是消化系统的致病菌,自1983年Marshall等首次从胃炎患者中分离培养成功后,就开始用抗生素根除治疗H.pylori[12]。但随着抗生素广泛应用,H.pylori的耐药性逐渐增加,开发有效的抗H.pylori药物是亟待解决的问题[13]。益生菌作为对人体有益的细菌,能通过细菌的相互竞争、分泌抗菌物质、阻止病原菌黏附等多种途径发挥抗菌效果[14],是解决H.pylori耐药的有效途径。相关研究表明,乳酸菌分泌的抗菌成分在体外发挥抗H.pylori效果[15],另外乳杆菌还能通过共聚集发挥抗H.pylori作用[16],具有替代抗生素治疗H.pylori的潜能。研究比较深入的还有罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌等,都具有一定的抗H.pylori作用,其抗H.pylori作用的机制与其能产生多种抗菌物质有关[17-18]。另外,虽然有研究表明双歧杆菌也具有一定的协同抗H.pylori作用[19],但本研究通过长双歧杆菌滴加于涂有H.pylori的哥伦比亚培养基内,放置三气培养箱内共培养,并未见有抗菌效果,原因可能是微氧环境下长双歧杆菌不能生长,无抗菌代谢物质产生。本研究在比较单种益生菌对H.pylori的抗菌效果时发现,枯草芽孢杆菌具有良好的抗菌效果。考虑到菌群构成了一个复杂的系统,本研究首次用两种益生菌的联合,检测包含有枯草芽孢杆菌的益生菌联合对H.pylori抗菌效果。发现两种益生菌的组合比单一使用枯草芽孢杆菌的抑菌效果更明显,这可能与细菌之间的相互作用及枯草芽孢杆菌能产生多种抗菌代谢产物有关。在选择两种益生菌组合时,枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌的组合与枯草芽孢杆菌+粪肠球菌的组合对H.pylori耐药菌种的抑制效果相当,但前者对H.pylori敏感菌株的抑菌效果更好,具体机制有待进一步深入研究。

综上所述,本研究发现:①单种益生菌中,枯草芽孢杆菌对敏感或耐药H.pylori均具有较好抑制作用,联合益生菌的抑菌效果优于单独使用;②枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌联合时,对H.pylori抗菌效果更佳,尤其是对临床耐药菌株。本研究为益生菌治疗H.pylori感染提供了新的思路,尤其是为益生菌对H.pylori耐药的治疗提供了实验依据。