5-羟色胺转运体基因多态性与不同民族创伤后应激障碍患者的关联性研究

李飞燕，郭敏，蒋湘玲，康延海，郭骏成，景嘉灏

海南省人民医院精神心理科，海南 海口 570311

创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder，PTSD)是人们经历超出寻常、灾难性、威胁性事件后延迟出现持久性焦虑反应[1]，临床表现为侵入性记忆、回避、警惕性增高、恐惧感等一系列持续的情绪、认知、行为等负面改变[2]。遗传可能在PTSD 的发病发展中发挥作用，研究表明遗传因素导致PTSD 发病风险上升30%～40%[3]。目前关于PTSD的遗传方面研究大多集中于5-羟色胺系统，且5-羟色胺是PTSD一线治疗药物选择性5-羟色素再摄取抑制剂的工作靶点[4]。5-羟色胺转运体基因(5-HTTLPR)有两个等位基因，即短(S，14重复)等位基因和长(L，16重复)等位基因。据报道携带5-HTTLPR 的S 等位基因军人患PTSD的风险增加[5]。研究还发现PTSD患者的5-HTTLPR 的SS基因型频率明显高于正常对照组[6]。5-HTTLPR的SS基因型和PTSD 发病之间存在关联性[7]。在针对中国人的研究中发现5-HTTLPR 与负性事件导致负面情绪具有相关性[7]。PTSD 患者表现出执行功能受损，如注意力、工作记忆等方面的认知障碍[9]。研究发现PTSD 患者存在认知损害，推测认知功能可能是PTSD 病因和维持重要因素[10]。国内研究也发现PTSD 患者出现记忆、学习、执行功能方面损害[11]。且临床上应用认知行为疗法能够减轻PTSD 患者创伤相关认知[12]。

国内未见有对海南省黎族、汉族PTSD 患者相关研究。本课题组的相关研究也证明了PTSD症状的严重程度存在民族差异性[13]。假设5-HTTLPR基因多态性与黎汉族PTSD患者发病机制及认知损害具有相关性。本研究从PTSD 患者5-HTTLPR 基因多态性出发，利用汉诺塔、威斯康星卡片分类测试、连线测验及韦氏成人智力量表等工具测量研究对象的执行及记忆等认知功能，探讨在海南省黎族和汉族人群中PTSD患者的发病机制与影响因素。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年10月至2018年7月在海南省人民医院就诊的308 例PTSD患者纳入研究组，其中黎族167 例，汉族141 例；男性188 例，女性120 例；年龄30～60 岁，平均(45.2±5.6)岁。入组标准：由两位精神专科主治以上医师按美国《精神疾病诊断与统计手册》第四版(DSM-Ⅳ)的PTSD诊断标准评估[14-15]，均应居住地位于海南岛，居住时间长达至少十年，家族三代及以上为相同民族，无血缘关系，年龄30～60 岁，既往健康。选取于2017 年10 月至2018 年7 月在海南省人民医院体检中心就诊的健康者158 例作为对照组，其中男性91例，女性67例，年龄30～60岁，平均(45.3±5.1)岁。排除标准：有家族遗传精神病史，有肿瘤等消耗性疾病者，妊娠期妇女。本研究经海南省人民医院伦理委员会批准，受到伦理委员会的监督，所有入组对象均签署知情同意书。

1.2 PTSD 指标检测 (1) PTSD 临床评定量表(clinician administered PTSD scale，CAPS)：CAPS 是一种结构化访谈，用于评估PTSD的核心及相关症状，使用标准的问题和明确的行为评估PTSD每个症状的频率和强度，判断PTSD 严重程度，频率和强度均采用5点记分法(尺度范围从0 到4)[16]。CAPS 是PTSD诊断的金标准之一，已成为诊断PTSD 最常用的测量工具。(2)埃森创伤问卷(Essen trauma inventory，ETI)：ETI 由德国学者Tagay 与其团队于2007 年根据DSM-Ⅳ的诊断标准编制自评问卷，问卷可用于评估创伤事件导致的创伤性应激障碍。ETI共5部分，采用4级评分制，0～4 分；得分越高，症状越严重。本研究选用量表第3 部分进行评估；包含23 个问题，内容涉及患者闯入症状、回避和激惹性增高，以及急性应激障碍有关的分离症状；PTSD 总分为23 个条目评分之和，PTSD 总分越高心理创伤越严重[17]。本研究采用ETI的4 个症状评分与PTSD 总分。(3)汉诺塔(Tower of Hanoi，TOH)：TOH 是心理学上经常用于测验被试者执行功能、工作记忆，抑制能力等等[18]。测验规则：①被试者只能移动一个木块；②大木块不能置在小木块之上；③木块只能放置柱子上或被试者手上。本研究选用TOH 移动操作手工版，测验内容有12 项，前6项为3木块，后6项为4木块，难度递增；被试者需将木块从原图形设置为目标图形，每次操作有6 次机会，连续成功2 次可进行下一步，反则终止操作；被试者总分越高、完成任务数越多成绩越好，平均计划时间和平均执行时间为越短成绩越好[19]。(4)威斯康星卡片分类测试(Wsiconsin card sorting test，WCST)：要求用四个分类卡片中的一个匹配刺激类型，其中所述刺激根据颜色(C)形状(S)和数目(N)被定义成多个维度的，每个维度限定了排序规则。通过反复试验，参与者必须在屏幕上给定顺序条目后做出选择(对或错)。经过连续10 个正确的排序规则的改变。有多达六个尝试导出规则，在以下的顺序提供5 个规则位移(C-S-N-C-S-N)，每个规则实现称为完成一个类别。在测试过程中参与者无法获知正确的排序原则和主要排序变化；直到所有的128 卡排序结束，不论参与者是否完成所有的规则变化测试结束。在这个过程中可能发生两种类型的错误。一种是持续性错误，参与者一直是参照错误的排序顺序作答。另一种是非持续性错误(随机错误)[20]。(5)连线测验(trail making test，TMT)：TMT 可用于测试认知功能；包含A、B 两部分；A 部分需要按序连接25 个数字，B 部分将25 个数字分布在正方形和圆形中，在两种图形中交替按序连接数字，均记录完成时间。完成时间越少，反映被试者执行功能越好[21]。(6)韦氏成人智力量表修订中国版(Wechsler Adult Intelligence Scale revised China，WAIS-RC)：它包括三个类别的智商分数：全量表智商，言语智商和操作智商。言语智商包括七个分测验：词汇、相似性、算术、数字广度、信息、理解和字母-数字排序。操作智商有六个分测验：填图、数字符号编码、分组设计、矩阵推理、图片排列以及符号搜索。这些测验的原始分数转换为分数比例[22]。

1.3 基因多态性检测 研究对象在完成一般资料及量表资料收集后，晨起空腹取肘前静脉血5～10 mL，EDTA 抗凝，在海南省人民医院中心实验室-20℃冻存。采用全血基因组DNA 提取试剂盒(OMEGA，美国)离心柱法提取基因组DNA，浓度以及纯度检测符合PCR 扩增要求[23]。研究采用5-HTTLPR序列，正向5'-GGCGTTGCCGCTCTGAATGC-3，反向5'-GAGGGACTGAGCTGGACAACCAC-3。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物及对PCR 产物进行测序。PCR 扩增反应体系共50 μL，含有基因组DNA 1 μL，一对引物各1 μL(10 μmol/L)，pfu 酶0.25 μL(5 U/μL)，10×Buffer 5 μL(200 mmol/L Tris HCl，pH 8.8；100 mmol/L KCl；20 mmol/L MgSO4；160 mmol/L (NH4)2SO4；1% Triton，1 mg/mL BSA)，dNTPs 1 μL(10 mmol/L)，去离子水40.75 μL。PCR 扩增循环参数：98℃预变性3 min，再以95℃变性1 min、60℃退火45 s、72℃延伸55，共35个循环，然后72℃延伸8 min[27]。PCR 试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0 软件对数据进行统计分析。符合正态分布的计量资料以均数±标准差(±s)表示，经方差齐性检验后多组间比较采用单因素方差分析，计数资料用构成比或率表示，采用χ2检验；基因位点Hardy-Weinberg平衡检验用χ2检验；基因型的相对危险度以优势比(odd ratio，OR)及95%可信区间(confidence interval，CI)表示。采用二分类Logistic回归分析发生PTSD的影响因素[27]。P为双侧检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 三组被试者的临床资料比较 三组被试者的平均年龄、性别构成、婚姻状况和受教育程度比较差异均无统计学意义(P＞0.05)。黎族PTSD 患者和汉族PTSD 患者的各ETI 评分与PTSD 总 分、TMT 时间、TOH 计划时间和执行时间、WCST 的错误数均明显高于对照组，WAIS-RC 中领悟、相似、木块图、物体拼凑及操作智商和TOH总分明显低于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)；黎族PTSD患者各ETI评分与PTSD 总分、TMT 时间明显高于汉族PTSD 患者，WAIS-RC中领悟、操作智商明显低于汉族PTSD患者，差异具有统计学意义(P＜0.05)，见表1和表2。

表1 三组被试者的一般资料比较Table 1 Comparison on the general data of the subjects among the three groups

表2 三组被试者的PTSD指标比较(±s)Table 2 Comparison on the PTSD data among the three groups(±s)

表2 三组被试者的PTSD指标比较(±s)Table 2 Comparison on the PTSD data among the three groups(±s)

注：与对照组比较，aP＜0.05；与黎族PTSD组比较，bP＜0.05。Note: Compared with the control group,aP＜0.05; compared with the PTSD group of Li nationality,bP＜0.05.

项目ETI评分闯入症状回避症状高度警觉症状分离症状PTSD总分WAIS-RC知识领悟算术相似数字广度词汇数字符号图画填充木块图图片排列物体拼凑语言智商操作智商总智商WCST分类数错误数正确数持续错误数随机错误数TMT A耗时数(秒)B耗时数(秒)TOH计划时间执行时间总分对照组(n=158)3.13±0.93 3.63±1.15 3.49±1.08 2.53±0.90 15.14±6.13 10.67±1.75 11.78±2.10 10.30±2.19 11.08±1.75 11.15±2.08 10.30±2.19 10.46±1.46 9.02±1.08 10.78±2.10 10.11±2.82 11.98±1.79 101.37±15.01 101.58±10.00 102.80±10.64 4.11±0.93 13.44±4.32 32.16±6.20 4.70±2.13 8.25±3.50 44.01±9.54 65.65±10.13 5.81±2.21 18.03±6.05 54.69±8.55汉族PTSD组(n=141)4.97±1.89ab 4.67±1.57ab 4.70±1.42ab 3.46±1.08ab 19.54±6.29ab 10.52±2.58 10.74±2.16ab 9.99±2.32 10.43±2.52 10.80±2.95 10.54±2.14 10.13±2.62 8.80±2.23a 9.97±1.47 9.78±2.18a 10.10±1.98 99.43±10.23 98.76±13.25ab 99.16±9.42a 3.91±1.03 19.04±4.25ab 31.18±4.27 4.88±2.52 8.38±2.64 51.16±10.57ab 75.79±9.00ab 7.15±2.03ab 24.93±6.96ab 47.15±8.66ab F值95.493 110.136 48.262 89.877 62.572 1.306 29.407 1.197 2.369 1.343 1.152 1.767 16.073 1.581 54.629 1.951 0.711 10.404 11.588 2.406 82.819 2.213 0.762 0.637 35.355 94.557 21.632 74.683 43.084 P值0.000 01 0.000 01 0.000 01 0.000 01 0.000 01 0.271 87 0.000 01 0.302 97 0.094 70 0.262 04 0.316 87 0.172 07 0.000 01 0.206 95 0.000 01 0.143 34 0.491 50 0.000 04 0.000 01 0.091 34 0.000 01 0.110 57 0.467 43 0.529 35 0.000 01 0.000 01 0.000 01 0.000 01 0.000 01

2.2 5 -HTTLPR基因多态性的分型 5-HTTLPR经PCR扩增后可检测到基因片段528 bp和484 bp，基因扩增产物分为SS 型、SL 型和LL 型3 种基因型，有杂合子(LS)和纯合子(LL/SS)区别，且目的片段为串联重复序列，故无需进行酶切即可从电泳胶图上识别出PCR 产物的基因型(图1)。

图1 5-HTTLPR基因多态性的PCR产物测序结果Figure 1 Sequencing results of the PCR products of the 5-HTTLPR polymorphisms

2.3 5 -HTTLPR基因型及等位基因分布 采用拟合优度检验进行Hardy-Weinberg 平衡检验，结果显示，研究对象中5-HTTLPR 基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P＞0.05)，本研究样本为随机样本，具有群体代表性。HTTLPR基因型和等位基因的分布在黎族PTSD 患者和对照组中比较差异无统计学意义(P＞0.05)。5-HTTLPR 基因型和等位基因的分布在汉族PTSD 患者和对照组中比较差异有统计学意义(P＜0.05)：与LL基因型比较，SS基因型可能会增加汉族人群患PTSD 的风险(OR=2.157，95%CI=1.098～4.237，P=0.024)；与L等位基因比较，S等位基因可能会增加汉族人群患PTSD 的风险(OR=1.456，95%CI=1.045～2.207，P=0.026)，见表3和表4。

表3 黎族PTSD 患者和对照组5-HTTLPR 基因型及等位基因频率分布比较[例(%)]Table 3 Comparison on genotype and allele frequency distribution of 5-HTTLPR genes between PTSD patients and control group of Li nationality[n(%)]

表4 汉族PTSD 患者和对照组5-HTTLPR 基因型及等位基因频率分布比较[例(%)]Table 4 Comparison on genotype and allele frequency distribution of 5-HTTLPR genes between PTSD patients and control group of Han nationality[n(%)]

2.4 5-HTTLPR 多态性与PTSD 的关系 黎族PTSD患者中，5-HTTLPR的SS基因型及LS基因型患者的各ETI 评分、PTSD 总分、TMT 时间、WAIS-RC 及WCST分别与LL基因型患者比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表4。汉族PTSD患者中，与5-HTTLPR的LL基因型患者比较，SS基因型的患者各ETI评分、PTSD总分、TMT时间明显增加，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，而WAIS-RC 中的领悟和算数和木块图及操作智商明显降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表5。

表5 5-HTTLPR多态性与汉族和黎族PTSD的关系(±s)Table 5 Relationship between 5-HTTLPR polymorphism and PTSD in Li nationality and Han nationality(±s)

表5 5-HTTLPR多态性与汉族和黎族PTSD的关系(±s)Table 5 Relationship between 5-HTTLPR polymorphism and PTSD in Li nationality and Han nationality(±s)

注：与黎族、汉族PTSD患者5-HTTLPR的LL基因型比较，aP＜0.05。Note:Compared with the LL genotype of 5-HTTLPR in PTSD patients of Li ethnicity and Han ethnicity,aP＜0.05.

项目ETI评分闯入症状回避症状高度警觉症状分离症状PTSD总分WAIS-RC知识领悟算术相似数字广度词汇数字符号图画填充木块图图片排列物体拼凑语言智商操作智商总智商WCST分类数错误数正确数持续错误数随机错误数TMT A耗时数B耗时数TOH计划时间执行时间总分LL(n=26)6.46±3.05 6.31±1.78 4.89±2.37 4.42±1.45 23.38±10.25 9.62±3.41 9.42±2.37 9.46±2.76 10.54±2.50 10.73±3.46 9.39±2.43 10.15±2.24 8.62±2.93 9.58±1.86 10.04±2.84 9.19±2.02 99.81±12.65 95.46±9.50 98.54±10.98 4.08±0.98 18.92±4.85 31.81±4.85 4.07±1.96 8.23±2.88 55.19±9.82 81.23±7.98 7.50±2.05 25.73±5.41 46.73±8.08 LS(n=83)5.83±2.21 6.15±1.90 5.25±1.85 4.41±1.59 24.06±7.97 10.61±2.88 9.85±2.34 10.17±2.96 10.07±2.56 10.45±3.46 10.16±2.59 10.20±2.75 8.60±2.50 9.64±2.22 9.51±2.54 9.93±2.15 98.45±9.84 96.86±10.33 97.51±9.56 3.80±0.88 18.72±4.08 30.78±6.61 5.23±2.47 8.90±3.00 53.35±12.65 79.12±8.67 6.95±2.27 26.48±5.99 45.54±9.63 SS(n=58)5.98±2.49 6.43±2.20 5.23±2.32 4.38±1.80 23.74±7.80 9.99±2.90 10.05±2.70 9.67±2.65 10.62±2.82 10.28±3.79 10.33±2.76 9.97±2.67 8.57±2.51 9.41±2.18 9.60±2.26 9.98±2.28 99.19±11.74 94.71±11.14 97.28±9.49 3.97±0.95 18.86±4.85 30.66±5.67 5.16±2.34 8.41±3.11 53.09±12.27 79.57±9.83 7.64±2.48 25.64±6.45 46.71±10.18 LL(n=18)3.72±1.07 3.66±1.33 3.67±1.28 2.56±1.04 15.44±7.46 10.44±2.50 12.11±3.27 11.56±2.68 10.50±2.46 11.11±2.81 10.78±1.99 10.50±2.75 9.16±2.43 11.06±1.11 10.17±2.09 9.72±1.60 100.3±9.49 107.7±15.93 101.6±9.17 4.06±1.00 18.11±6.18 32.22±3.75 4.89±3.18 7.50±2.96 48.89±15.90 71.50±7.46 7.17±1.98 21.94±7.79 47.44±8.56 LS(n=62)4.79±2.15 4.05±1.08 4.32±1.39 3.15±0.96 17.69±4.78 10.40±2.92 12.08±0.87 10.92±2.19 10.10±2.86 10.84±2.93 10.39±2.40 10.05±2.60 8.74±2.20 10.61±1.06 9.45±2.46 10.42±1.92 98.68±11.58 102.1±11.76 98.40±10.50 3.73±1.12 18.21±1.90 30.29±4.67 4.94±2.30 8.50±2.71 45.66±3.54 72.65±7.20 7.00±2.32 24.79±7.08 46.48±9.90 SS(n=61)5.53±1.48a 5.59±1.59a 5.44±1.06a 4.05±0.88a 22.62±5.92a 10.67±2.26 8.99±1.22a 8.57±1.41a 10.74±2.15 10.67±3.04 10.62±1.92 10.11±2.63 8.75±2.23 9.00±1.34a 10.00±1.88 9.88±2.13 99.92±9.02 92.70±11.16a 99.21±8.32 4.05±0.92 20.15±5.05 31.79±3.85 4.80±2.61 8.51±2.47 57.43±10.18a 80.26±9.18a 7.30±1.74 25.95±6.43 47.74±7.33 5-HTTLPR(黎族) 5-HTTLPR(汉族)

2.5 PTSD的影响因素 患者的年龄、性别、婚姻状况、受教育程度、5-HTTLPR 位点多态性与黎族、汉族PTSD 患者的相关性采用二分类Logistic 回归分析，以有无患病为因变量，分析结果显示：5-HTTLPR 的SS 基因型与汉族PTSD 显著相关，使PTSD 患者患病风险增高(P＜0.05)，年龄、性别、婚姻状况、受教育程度与黎族、汉族PTSD 无明显相关(P＞0.05)，见表6。

表6 PTSD影响因素的二分类Logistic回归分析Table 6 Binary Logistic regression analysis of influencing factors of PTSD

3 讨论

创伤后应激障碍对个人和整个社会造成严重的健康、社会和经济负担[24]。5-HTTLPR在PTSD的发生和治疗中起着重要作用[25]。为了进一步探讨5-HTTLPR基因多态性对PTSD的影响，本研究纳入来自海南省的黎族和汉族PTSD 患者，了解5-HTTLPR 基因多态性与PTSD 的关联性。5-HTTLPR 有S 基因位点和L基因位点，划分为SS、SL和LL基因型。研究发现携带5-HTTLPR 基因的SS 基因型PTSD 患者高于其他基因型[26]。同样有研究表明5-HTTLPR 的SS 基因型或S 等位基因可增加患PTSD的风险[27]。本研究也发现5-HTTLPR 基因中SS 基因型和S 等位基因增加了海南汉族人群患PTSD 的风险，且携带5-HTTLPR 的SS 基因型较LL 基因型的PTSD 患者的PTSD 总分更高、症状更加严重。同样有研究发现携带5-HTTLPR基因中S 等位基因的PTSD 患者与纯合L 等位基因患者比较，PTSD症状更加恶化[7]。5-HTTLPR基因中的SS 基因型/S 等位基因与PTSD 存在相关性，可能是PTSD患者的主要危险因素。

研究发现5-HTTLPR基因多态性与PTSD患者的认知功能有关[28]。许多关于PTSD的研究中都发现患者执行功能、记忆等认知功能存在不同程度损害[29]。本研究也发现黎汉两组PTSD 患者的执行、记忆等认知功能受到损害，黎汉两组PTSD 患者的TMT 时间、TOH计划时间和执行时间、WCST错误数均高于对照组。关于战俘PTSD研究也发现患者的WCST错误数较对照组更高，认知功能损害更加严重[30]。携带5-HTTLPR 基因的SS 基因型汉族PTSD 患者较LL 基因型患者，其TMT时间明显增加，WAIS-RC中的领悟和算数和木块图及操作智商明显降低，表明SS基因型PTSD患者的认知功能损害更加严重。关于中国儿童PTSD 患者的研究也发现含有SS 基因型较SL 基因型的患者认知损害更加严重，提出5-HTTLPR基因多态性与中国汉族创伤后应激障碍患儿的认知功能障碍相关[31]。本研究还发现PTSD 患者的WAIS-RC 相似性、分块模式、理解、对象组装和操作的IQ 低于对照组，说明PTSD 症状可能与患者智商及教育程度有关。研究发现PTSD 患者的言语、工作记忆和注意力及言语智力与PTSD 症状呈负相关，证实患者智商和教育程度与PTSD症状存在相关性[32]。

然而研究还是存在缺陷性，未发现5-HTTLPR基因多态性与黎族PTSD 患者关联性，原可能是样本量可能不足及群体间的差异可能影响了5-HTTLPR 基因多态性。此外，基于人群的差异，特别是在被测多态性与基因中其他潜在变异之间的连锁不平衡程度上，可能促成了这一不一致的发现。本研究的发现为未来研究开辟了一条新的途径，可能有助于深入了解基因多态性与PTSD 之间的关系，需要未来的研究者继续进一步探究。