速康宁滴眼液和速康宁滴鼻液的生物检查方法适用性研究▲

雷 宇 秦银燕 何成章 陆 华 陈贞伶

(广西医科大学第一附属医院药学部,广西南宁市 530021)

生物检查方法是考察药物制剂疗效及安全性的一种重要方法。《中华人民共和国药典(2015年版)》[1]明确要求对药品的微生物检查方法需要进行适用性试验,使检查结果更具可比性,接近于国际标准。速康宁滴眼液和速康宁滴鼻液是广西医科大学第一附属医院自行生产的医院制剂,多年的临床应用实践表明这两种药物的安全性好,疗效显著。速康宁滴眼液和速康宁滴鼻液的处方成分相同,主要成分包含硫酸庆大霉素、地塞米松磷酸钠等。由于上述制剂本身具有很强的抑菌作用,建立适宜的生物学检查方法以保证制剂的药品质量,具有重要意义。本研究参照《中华人民共和国药典(2015年版)》[1]及相关文献[2]的相关要求进行了系列实验研究,初步探讨速康宁滴眼液和速康宁滴鼻液的生物学检查方法,现报告如下。

1 材 料

1.1 仪器 BSC-1600ⅡA2型生物洁净安全柜、SW-CJ-ICU型净化工作台(苏州安泰空气技术有限公司),LDZF-50L-Ⅱ型立式高压蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂),DHP-9270型隔水式恒温培养箱、MJ-250-Ⅱ型霉菌恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司),101-2AS型鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司),HTY-601型智能集菌仪、PY220型集菌培养器(杭州泰林生物技术股份有限公司)。

1.2 供试品 速康宁滴眼液(规格:10 mL/支;批号:20190722、20190723、20190724)、速康宁滴鼻液(规格:10 mL/支;批号:20190717、20190718、20190719)均由广西医科大学第一附属医院制剂室生产。

1.3 试验用菌株 金黄色葡萄球菌[菌号:CMCC(B)26003;批号:E0009B;有效期至2021-01-28)]、铜绿假单胞菌 [菌号:CMCC(B)10104;批号:E0042B;有效期至2021-01-01)]、大肠埃希菌[菌号:CMCC(B)44102;批号:E0019B;有效期至2021-04-18)]、枯草芽孢杆菌[菌号:CMCC(B)63501;批号:E0020B;有效期至2021-04-18]、白色念珠菌[菌号:CMCC(F)98001;批号:E0047B;有效期至2021-07-22]、黑曲霉菌[菌号:CMCC(F)98003;批号:E0054B;有效期至2021-09-21]均购自广东环凯微生物科技有限公司;生孢梭菌[菌号:CMCC(B)64941,批号:190726,有效期至2020-07-25]购自北京三药科技开发公司。

1.4 培养基和试剂 胰酪大豆胨液体培养基(批号:180524)、胰酪大豆胨琼脂培养基(批号:180820)、沙氏葡萄糖琼脂培养基(批号:180719)、沙氏葡萄糖液体培养基(批号:180731)、硫乙醇酸盐流体培养基(批号:180621)、麦康凯液体培养基(批号:180801)、麦康凯琼脂培养基(批号:180412)、溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基(批号:180327)、甘露醇氯化钠琼脂培养基(批号:190402)、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH为7.0,批号:181213)均购自北京陆桥技术股份有限公司;含0.05%(体积比)聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(pH为7.0)、0.9%无菌氯化钠溶液、含0.1%(体积比)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液均为广西医科大学第一附属医院制剂室自配。以上培养基均符合《中华人民共和国药典(2015年版)》[1]中的适用性试验相关规定,可用于无菌检查和微生物限度检查。

2 方法与结果

2.1 菌悬液的制备

2.1.1 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌菌悬液的制备:将金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物分别接种至胰酪大豆胨液体培养基,在(33±2)℃的恒温培养箱中培养24 h,取上述培养物1 mL加到9 mL含0.05%(体积比)聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中,按10倍递减稀释1×105至1×107倍,制成菌落数在50～100 CFU/mL的菌悬液。

2.1.2 生孢梭菌菌悬液的制备:将生孢梭菌新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基,在(33±2)℃的恒温培养箱中培养24 h,取上述培养物1 mL加到9 mL含0.05%(体积比)聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中,按10倍递减稀释1×105至1×107倍,制成菌落数在50～100 CFU/mL的菌悬液。

2.1.3 白色念珠菌菌悬液的制备:将白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基,在(23±2)℃的恒温培养箱中培养3 d,取上述培养物1 mL加到9 mL含0.05%(体积比)聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中,按10倍递减稀释1×105至1×107倍,制成菌落数在50～100 CFU/mL之间的菌悬液。

2.1.4 黑曲霉菌菌悬液的制备:将黑曲霉菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基,在(23±2)℃的恒温培养箱中培养7 d,取上述培养物加到3～5 mL含0.05%(体积比)聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中,用无菌玻璃棒或接种环轻轻将孢子洗脱,然后用管口带有无菌薄纱布的吸管吸出孢子悬液至无菌试管内,取上述孢子悬液1 mL加到9 mL含0.05%(体积比)聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中,按10倍递减稀释1×10-2至1×10-5倍,制成菌落数在50～100 CFU/mL之间的菌悬液。

2.2 菌悬液计数 取2.1中的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的菌悬液1 mL分别注入90 mm的无菌平皿,再注入15～20 mL不超过45 ℃的胰酪大豆胨琼脂培养基至培养皿,迅速混匀,每种实验菌平行制备2皿。在(33±2)℃的恒温培养箱中培养3 d。取2.1中的生孢梭菌菌悬液1 mL注入含30 mL硫乙醇酸盐流体培养基的试管,平行制备2管,在(33±2)℃的恒温培养箱中培养3 d。取2.1中的白色念珠菌菌悬液、黑曲霉菌菌悬液各1 mL注入含18 mL 45 ℃沙氏葡萄糖琼脂培养基的培养皿,每种实验菌平行制备2皿,在(23±2)℃的恒温培养箱中培养5 d。菌落计数结果见表1。

表1 各实验菌的菌落计数结果

2.3 速康宁滴眼液无菌检查方法适用性试验及结果

2.3.1 薄膜过滤法冲洗操作步骤:以0.9%无菌氯化钠溶液和含0.1%(体积比)聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂。采用智能集菌仪和集菌培养器进行采样,每膜最大载样量为50 mL。根据《中华人民共和国药典(2015年版)》[1]相关规定,以大肠埃希菌、生孢梭菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作为实验菌,各实验菌逐一进行实验。(1)第1次预实验。以0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂,每次冲洗量为100 mL,每膜冲洗3次,共300 mL。按规定观察至第5天时,供试品阳性组的金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌管的溶液仍澄清,未见目标菌株生长,表明用上述方法仍不能消除供试品对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的干扰,因此,筛选出金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为敏感菌进行下一步实验。(2)第2次预实验。根据第1次预实验结果筛选出金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为敏感菌,操作同“第1次预实验”,以0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗液,分别以400 mL、500 mL作为总冲洗量,依次进行冲洗,每次每膜冲洗量为100 mL。每膜总冲洗量为400 mL时,按规定观察至第5天,供试品阳性组仍未见2种敏感菌生长。每膜总冲洗量为500 mL时,供试品阳性组的金黄色葡萄球菌在培养至第4天时,可见微弱生长,按规定观察至第5天时可见供试品阳性组的金黄色葡萄球菌生长良好,但枯草芽孢杆菌管溶液仍澄清,仍未见目标菌生长,因此,筛选出枯草芽孢杆菌作为敏感菌进行下一步实验。(3)第3次预实验。根据第2次预实验结果进一步筛选出枯草芽孢杆菌作为敏感菌,以含0.1%(体积比)聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂,分别以300 mL、400 mL、500 mL作为总冲洗量,依次进行冲洗,每次每膜冲洗量为100 mL。每膜总冲洗量为500 mL时,按规定观察至第5天时,供试品阳性组试管浑浊,枯草芽孢杆菌生长良好。预实验结果见表2。

2.3.2 预实验分组:(1)供试品阳性组。取30支速康宁滴眼液作为供试品,使用两套无菌集菌培养器吸取至滤筒内,每套培养器滤过15支速康宁滴眼液,按薄膜过滤法进行过滤。按2.3.1方法逐一进行预实验,每次预实验中的最后一次冲洗剂中加入1 mL 50～100 CFU/mL的实验菌菌悬液,过滤结束后,在接种大肠埃希菌、生孢梭菌、金黄色葡萄球菌的滤筒内加入100 mL硫乙醇酸盐流体培养基,将其置于(33±2)℃的恒温培养箱中培养,在接种枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的滤筒内加入100 mL胰酪大豆胨液体培养基,将其置于(23±2)℃的恒温培养箱中培养,培养时间均为5 d,每隔24 h观察1次。(2)冲洗剂阳性组。取当次实验用的冲洗剂替代供试品,按“供试品阳性组”同法操作。(3)阳性组。取两套无菌集菌培养器,不滤过供试品或冲洗剂。在其中一套无菌集菌培养器中直接加入硫乙醇酸盐流体培养基100 mL,分别接种1 mL 50～100 CFU/mL的大肠埃希菌、生孢梭菌、金黄色葡萄球菌的菌悬液至滤筒内;另一套直接加入胰酪大豆胨液体培养基100 mL,分别接种1 mL 50～100 CFU/mL的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液至滤筒内。(4)供试品本底菌组。按“供试品阳性组”同法操作,但取当次实验用的冲洗剂替代菌悬液。(5)阴性组。操作同“供试品本底菌组”,但取当次实验用的冲洗剂替代供试品。

2.3.3 结果判断:在培养时间内,供试品阳性组、阳性组、冲洗剂阳性组溶液均出现浑浊,且出现浑浊时间相近,供试品本底菌组、阴性组溶液均澄清,则说明实验结果符合规定。若阴性组溶液浑浊且确认有菌生长,则认为实验无效[1]。本实验用6株规定实验菌对供试品逐一进行加菌实验,结果显示,以0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂,总冲洗量为300 mL时,以大肠埃希菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作为实验菌的供试品阳性组、阳性组、冲洗剂阳性组的溶液均出现浑浊,供试品本底菌组、阴性组溶液均澄清,说明对以上实验菌株的实验结果符合规定,但金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的实验结果不符合规定。因此,第2次预实验以金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为敏感菌,并将总冲洗量加到500 mL,结果显示金黄色葡萄球菌的实验结果符合规定,而枯草芽孢杆菌的实验结果仍不符合规定。第3次预实验以枯草芽孢杆菌作为敏感菌,用含0.1%(体积比)聚山梨酯80的 0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂,每膜总冲洗量为500 mL时结果显示枯草芽孢杆菌的实验结果符合规定,见表2。

表2 速康宁滴眼液薄膜过滤法预实验结果

根据上述预实验结果,我们对3个不同批次(20190722、20190723、20190724)的速康宁滴眼液供试品进行适用性验证,其结果与预实验结果完全一致,提示该方法重复性好,可作为速康宁滴眼液无菌检查方法。

2.4 速康宁滴鼻液微生物限度检查方法适用性试验及结果

2.4.1 倾注平皿法预实验(1 mL/皿):(1)供试液的制备。① 取供试品10 mL,加入无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至90 mL,制得①液(1 ∶10供试液);②取①液20 mL,加入无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液80 mL,制得②液(1 ∶20供试液);③取①液50 mL,加入无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液50 mL,制得③液(1 ∶50供试液)。(2)分组进行实验。① 供试品阳性组。取7个实验管,每管加入供试液9.9 mL。其中,5管分别加入0.1 mL(<104CFU/mL)的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液,混匀,取1 mL混合液注入平皿(平行制备2皿),再向平皿中注入15～20 mL温度不超过40 ℃的胰酪大豆胨琼脂培养基,混匀,凝固后倒置,放于(33±2)℃的恒温培养箱培养3 d。另2管分别加入0.1 mL(<104CFU/mL)的白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液,混匀,取1 mL混合液注入1个平皿,平行制备2皿,再向平皿中注入15～20 mL温度不超过40 ℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基,混匀,凝固后倒置,放于(23±2)℃的恒温培养箱培养5 d。② 阳性组。取无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液,其他步骤同“供试品阳性组”。③ 供试品本底菌组。取无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代菌悬液,其他步骤同“供试品阳性组”。④ 阴性组。取无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液替代供试液,其他步骤同“供试品本底菌组”。第1次预实验中,分别取供试品原液、① 液作为供试液,以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌5种实验菌作为需氧菌总数计数的代表菌,以白色念珠菌、黑曲霉菌2种实验菌作为霉菌和酵母菌总数计数的代表菌,各实验菌逐一进行微生物回收实验。第2次预试验中,分别取②液、③液作为供试液,根据第1次实验结果筛选出金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌作为敏感菌进一步行加菌回收实验。(3)结果判断[6]。各实验菌菌数回收率均在50%～200%范围内,提示所采用的方法适用于该制剂的实验菌总数计数检查。若阴性组有菌生长,则认为实验无效。实验菌菌数回收率=(供试品阳性组平均菌落数-供试品本底菌组平均菌落数)/阳性组平均菌落数×100%。本研究结果提示,采用倾注平皿法(1 mL/皿),把供试品稀释成1 ∶50的供试液对需氧菌总数项进行加菌回收实验,3株敏感实验菌(铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)的菌数回收率均>50%,该方法可作为该制剂的需氧菌总数计数的检查方法,但由于供试品的稀释比例较大,本底菌同时也会被稀释,存在不被检出的风险,不建议采用此方法检测铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌。另使用1 ∶10供试液进行霉菌和酵母菌总数计数,白色念珠菌、黑曲霉菌的菌数回收率均>50%,故该方法可作为霉菌和酵母菌总数计数的检查方法。见表3。

表3 速康宁滴鼻液倾注平皿法预实验结果

2.4.2 薄膜过滤法预实验:根据2.4.1实验结果,采用倾注平皿法检测方法时,存在需氧菌不被检出的风险,因此采用薄膜过滤法进行需氧菌总数计数。用①液作为供试液,每膜过滤供试液10 mL,以筛选出来的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌作为敏感菌,以0.9%无菌氯化钠溶液或含0.1%(体积比)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂,对各敏感菌逐一进行微生物回收实验,其中每种冲洗剂均分别以400 mL、500 mL作为总冲洗量,依次冲洗滤膜,每次100 mL。分组及操作步骤同速康宁滴眼液的薄膜过滤法。结果显示,以0.9%无菌氯化钠作为冲洗剂,每膜冲洗量加至500 mL时,铜绿假单胞菌回收率仍<50%。因此,改用含0.1%(体积比)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂,每膜冲洗量加至500 mL时,结果显示铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的菌数回收率均>50%,见表4。

表4 速康宁滴鼻液薄膜过滤法预实验结果

2.4.3 速康宁滴鼻液微生物限度检查方法适用性试验及结果:为检验预实验方法的可行性,本研究取3个批次的速康宁滴鼻液(20190717、20190718、20190719),采用薄膜过滤法,用含0.1%(体积比)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂,每膜冲洗总量为500 mL,以金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌作为代表菌,对需氧菌总数计数检查方法进行适用性试验;采用倾注平皿法(1 mL/皿),取1 ∶10供试液,以白色念珠菌、黑曲霉菌作为代表菌,对霉菌和酵母菌总数计数检查方法进行适用性试验。结果显示各实验菌回收率均在50%～200%,与预实验结果一致,表明该检查方法的重复性好,验证方法可靠。见表5、表6。

表5 3个批次速康宁滴鼻液薄膜过滤法适用性试验结果

表6 3个批次速康宁滴鼻液倾注平皿法适用性试验结果

2.5 速康宁滴鼻液控制菌检查方法适用性试验及结果 根据《中华人民共和国药典(2015年版)》[1]相关规定,鼻用制剂对控制菌的要求为每1 g、1 mL、10 cm2的供试品不得检出大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。速康宁滴鼻液的控制菌检查方法主要用于在符合上述规定的条件下,检查本供试品中是否存在大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。 因此,对速康宁滴鼻液的控制菌检查方法进行适用性试验,以达到去除供试品的抑菌成分对实验菌干扰的目的,确认所选用的方法是否适用于速康宁滴鼻液的控制菌检查。

2.5.1 金黄色葡萄球菌:(1)供试品阳性组。① 直接接种法。取2.4.1制备的①液(1 ∶10供试液)10 mL和菌落数为50～100 CFU/mL的金黄色葡萄球菌的菌悬液1 mL,分别接种至100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL的胰酪大豆胨液体培养基,在(33±2)℃的恒温培养箱中培养18 h。② 薄膜过滤法。取2.4.1制备的①液(1 ∶10供试液)10 mL,以含0.1%(体积比)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂,按2.3.1中有关薄膜过滤法的操作方法,分别以400 mL、500 mL作为总冲洗量,依次进行冲洗,每膜每次冲洗100 mL,过滤结束后,用无菌镊子将滤膜取出,分别接种至100 mL胰酪大豆胨液体培养基,在(33±2)℃的恒温培养箱中培养18 h。(2)阳性对照组。用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液,其余操作同供试品阳性组。(3)供试品本底菌组:用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌悬液,其余操作同供试品阳性组。(4)阴性组:用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液代替供试液、菌悬液,其余操作同供试品阳性组。(5)选择与分离培养。取上述各组的液体培养物,接种至含甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上,再在(33±2)℃的恒温培养箱中培养18 h。(6)结果判断。在含甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上,如果没有符合金黄色葡萄球菌形态特征的菌落生长,则判定为未检出,反之则判定为检出。

2.5.2 铜绿假单胞菌:(1)分组。用铜绿假单胞菌替代2.5.1中的金黄色葡萄球菌,分组和操作同2.5.1。(2)选择与分离培养。取各组的液体培养物,划线于含溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上,再在(33±2)℃的恒温培养箱中培养24 h。(3)氧化酶试验。将无菌的滤纸片放在平皿上,用无菌玻璃棒在上述平板蘸取生长的菌落涂于纸片上,再滴加2滴新配制的1%二盐酸N,N-二甲基对苯二胺试液,若在30 s内培养物变成粉红色并且逐渐变紫红色,则判定为氧化酶试验阳性,反之则为阴性。(4)结果判断。在含溴化十六烷基二甲铵琼脂培养基的平板上,如果没有符合铜绿假单胞菌形态特征的菌落生长,则判定为未检出,反之则判定为检出。

2.5.3 大肠埃希菌:(1)分组。用大肠埃希菌替代2.5.1中的金黄色葡萄球菌,分组和操作同2.5.1。(2)选择与分离培养。取各组的液体培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基,在(43±1)℃的恒温培养箱中培养24 h,取麦康凯液体培养基中的培养物划线于含麦康凯琼脂培养基的平板,在(33±2)℃的恒温培养箱中培养18 h。(3)结果判断。在含麦康凯琼脂培养基的平板上,如果没有符合大肠埃希菌形态特征的菌落生长,则判定为未检出,反之则判定为检出。

2.5.4 速康宁滴鼻液控制菌检查方法适用性试验结果:第1次预实验采用常规法(直接接种法),用金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌作为实验菌,按2.5.1、2.5.2、2.5.3进行操作,对各实验菌逐一进行检测。结果显示,在接种至100 mL、200 mL、300 mL、400 mL、500 mL体积的胰酪大豆胨液体培养基中,阳性组均检出3种实验菌株,阴性组均无菌生长,供试品阳性组均未检出3种实验菌。见表7。第2次预实验采用薄膜过滤法,实验分组及实验菌同第1次预实验,结果显示,每膜总冲洗量为400 mL,供试品阳性组的3种实验菌均仍未见检出;每膜总冲洗量为500 mL,供试品阳性组均能检出3种实验菌株。另取3个批次(20190717、20190718、20190719)速康宁滴鼻液样品按上述方法进行控制菌检查方法适用性试验,结果显示,3个批次供试品阳性组均能检出相应的目标菌,说明验证方法可靠。

表7 速康宁滴鼻液控制菌检查方法适用性试验的预实验结果

3 讨 论

与2010年版的《中华人民共和国药典》相比,2015年版的《中华人民共和国药典》生物检查法在检查方法和指导原则上均有较大的修订,变更内容涵盖所用培养基、实验用菌、加菌方式及判定标准等[1-2]。因此,原有的生物检查法已不能满足新版药典的检验要求。本研究根据新版药典的要求,针对速康宁滴眼液和滴鼻液建立新的生物限度检查方法。

根据《中华人民共和国药典(2015年版)》规定,应对眼用制剂进行无菌检查,应对鼻用制剂进行微生物限度检查,且应对上述检查方法进行适用性试验,以确认所采用的方法适用于该制剂。本研究先通过预实验用1个批次的制剂(眼用制剂和鼻用制剂)筛选出敏感菌,以确定初步的实验方案,从而提高工作效率,快速有效地建立适宜检查方法[3-6]。我们在对含有硫酸庆大霉素抑菌成分的速康宁滴眼液进行薄膜过滤法预实验时发现,以0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂时,冲洗量增至500 mL,枯草芽孢杆菌的实验结果仍未符合标准,因此我们采用聚山梨酯80类非离子表面活性剂作为冲洗剂,一方面该冲洗剂不具有抑菌性,另一方面该冲洗剂不对微生物造成损伤,在薄膜过滤法中起到很好的作用,既可以增加样品的溶解性,又可增加冲洗液的洗脱力度,而且对微生物也有保护作用,可有效消除供试品对实验菌的抑菌活性[7]。本研究对3个批次(20190722、20190723、20190724)的速康宁滴眼液供试品进行适用性试验,结果与预实验结果一致,重复性好,可作为速康宁滴眼液无菌检查方法,这提示采用薄膜过滤法可以对速康宁滴眼液进行无菌检查。

我们对速康宁滴鼻液进行微生物限度检查时,采用倾注平皿法及1 ∶10供试液进行预实验,发现用于霉菌和酵母菌总数计数的2株实验菌在各阳性组中生长良好,实验菌菌数回收率在50%～200%范围内,因此可以选择使用倾注平皿法对霉菌和酵母菌进行微生物限度检查。虽然3株(铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌)需氧菌敏感菌在1 ∶50供试液中的实验菌菌数回收率合格,但是不能排除由于稀释比例过大导致供试品本底菌同时被稀释而不被检出的风险,因此选择使用薄膜过滤法对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌进行微生物限度检查,并以含0.1%(体积比)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂,均得到较好的实验菌菌数回收率。因此,笔者建议,对类似硫酸庆大霉素等抗菌药物的制剂品种进行需氧菌验证实验时,可直接以含0.1%(体积比)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂(冲洗量为500 mL)进行薄膜过滤法验证。

综上所述,可采用薄膜过滤法对速康宁滴眼液进行无菌检查,但需要采用聚山梨酯80类非离子表面活性剂作为冲洗剂对枯草芽孢杆菌进行检测;薄膜过滤法和倾注平皿法均可用于速康宁滴鼻液的微生物限度检查,但对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌进行微生物限度检查时,建议以含0.1%(体积比)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液作为冲洗剂进行薄膜过滤法检查,而对于霉菌和酵母菌,采用倾注平皿法进行微生物限度检查即可获得较好的结果。