线粒体靶向药MitoQ对病毒性心肌炎保护作用的相关研究

蔡银链,王圣楠,王耀国,徐 玲

(福建医科大学附属第二医院,福建 泉州 362000)

病毒性心肌炎属于感染性心肌病,其特征为心肌弥漫性或局限性病变,病毒感染是导致该病的重要原因,最为常见的病毒为柯萨奇B3 病毒(Coxsackievirus B3, CVB3)[1]。当前临床上仍缺少有效的针对性治疗手段,多数患者及时治疗后可痊愈,但也有少量患者因病毒性心肌炎急性发作导致心律失常、心力衰竭等情况[2]。

MitoQ是一种线粒体靶向抗氧化剂,近年来被证实在肿瘤、脑线粒体氧化应激中发挥重要作用[3, 4]。此外,其在心脏保护中的作用也逐渐被揭示,如李鹏等通过研究发现MitoQ能够抑制高糖诱导的心肌细胞线粒体功能障碍[5]。此外也有研究证实MitoQ能够抑制高糖导致的心肌细胞铁死亡以及心肌细胞焦亡[6]。另外有关于MitoQ和CVB3的研究发现,MitoQ能够抑制线粒体活性氧并且抑制CVB3的复制[7]。考虑到CVB3是导致心肌炎的一个重要原因,我们推测MitoQ可能在病毒性心肌炎中发挥作用。

本研究通过CVB3诱导的方式构建病毒性心肌炎小鼠模型,旨在探讨MitoQ在病毒性心肌炎治疗中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

雄性BALB/c 小鼠均购自上海斯莱克实验动物有限公司[SCXK(沪)2012-0002];CVB3病毒由武汉大学病毒研究所赠予;MitoQ购自美国Focus biomolecules公司;HE染色试剂盒(C0105)、RIPA裂解液(P0013B)购自上海碧云天;BCA试剂盒(HR0329)购自北京百奥莱博科技有限公司;Bax抗体(ab216494)、Bcl-2抗体(ab196495)、GAPDH抗体(ab8245)均购自英国ABCAM;ECL显影液(WBKIS0100购自Millipore;ROS(E004-1-1)和SOD试剂盒(A001-3-2)购自南京建成生物工程研究所;TNF-α的ELISA试剂盒(E-EL-M3060)以及IL-6的ELISA试剂盒(E-MSEL-M0001)购自Elabscience公司。

1.2 CVB3处理小鼠构建病毒性心肌炎动物模型

购买雄性BALB/c 小鼠50只,借助随机数字表法将小鼠分为对照组、病毒性心肌炎组、MitoQ(2 mg/kg)组、MitoQ(4 mg/kg)组、MitoQ(8 mg/kg)组,每组10只。对照组小鼠通过腹腔注射的方式给予2 mL 0.9%氯化钠溶液,连续注射7天。另外4组腹腔注射0.2 mL含1.0×106滴度的CVB3病毒以构建病毒性心肌炎模型,腹腔注射病毒6 h后MitoQ治疗组小鼠继续腹腔注射不同浓度MitoQ,处理时间7天,之后采用5%浓度戊巴比妥钠对小鼠进行麻醉,之后断颈处死小鼠并且取小鼠心脏和血清标本。

1.3 HE染色检测小鼠心肌病理情况

将留取的各组小鼠心肌组织在4%多聚甲醛固定24 h,PBS冲洗。脱水以及石蜡包埋组织后制成蜡块并且依据HE染色试剂盒说明书要求行HE染色。由我院资深病理科医师对各组心肌组织炎症分布情况进行评分:无炎性细胞浸润记为0分,炎性浸润面积低于25%记为1分,炎性浸润面积在大于等于25%并低于50%记为2分,炎性浸润面积大于等于50%并低于75%记为3分,炎性浸润面积大于等于75%并低于100%记为4分[8]。

1.4 Western blot检测凋亡相关蛋白表达

收集各组小鼠心肌组织并研磨,之后加入RIPA裂解液进行裂解并且冰上反应30 min。12000 r/min的转速离心,BCA试剂盒对蛋白浓度进行测定。取50μg蛋白样本行10%SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转移至PVDF膜,TBST溶液进行阻断。加入一抗Bax、Bcl-2,4℃下过夜孵育。次日在室温下复苏1h,TBST冲洗后添加辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗IgG孵育2小时,TBST冲洗。ECL显影,Image J对目标条带进行量化分析,根据GADPH蛋白值进行归一化。

1.5 试剂盒检测心肌组织氧化应激指标的影响

收集各组小鼠心肌组织,剪碎后置于冰上匀浆,依据ROS和SOD试剂盒说明书对各组小鼠心肌组织中ROS和MDA水平进行测定。

1.6 ELISA法检测血清心肌损伤标志物和炎性因子水平

ELISA法对小鼠血清中肌钙蛋白I(Troponin I,cTnI)、B 型脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)水平以及炎性因子(TNF-α、IL-6)的水平。取出各组血清样本并在室温放置1 h,4℃条件下以2000 r/min的转速离心10 min,之后取上清液并且依据ELISA试剂盒说明书对cTnI、BNP、TNF-α、IL-6的水平进行检测。

1.7 统计学分析

数据分析使用SPSS23.0软件进行,计量资料以均值±标准差的形式表示。两组间差异比较采用t检验,单因素方差分析法与Tukey事后检验用于多组间数据比较。P<0.05差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MitoQ对病毒性心肌损伤的影响

HE染色实验结果显示(图1),对照组小鼠心肌细胞完整、形态正常,可见排列整齐的心肌纤维且不存在炎性细胞浸润。而模型组小鼠心肌细胞大量坏死、细胞核形状改变,炎性因子大量覆盖。随着MitoQ剂量的增加,心肌细胞病理学变化逐渐改善,心肌细胞坏死、断裂溶解减少。对比各组病理反应评分发现,与对照组比较,病毒性心肌炎组病理评分增加,随着MitoQ剂量的增加病理评分也逐渐减少(F=284.8,P<0.0001)。

图1 HE染色结果观察和各组病理评分

2.2 各组小鼠血清cTnI 和BNP 水平比较

与对照组比较,病毒性心肌炎组小鼠血清cTnI、BNP 水平均增加(均P<0.05);而与病毒性心肌炎组比较,MitoQ治疗组小鼠血清cTnI、BNP水平随MitoQ浓度的增加呈剂量依赖性降低(均P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠血清cTnI 和BNP 水平

2.3 MitoQ影响心肌细胞凋亡相关因子水平

Western blot实验显示,相较于对照组,病毒性心肌炎组凋亡促进因子Bax表达升高而凋亡抑制因子Bcl-2则显著下调(P<0.05);另外与病毒性心肌炎组比较,随着MitoQ剂量增大,凋亡促进因子Bax表达水平下降,而凋亡抑制因子Bcl-2表达水平则逐渐上升。见表2。

表2 各组小鼠心肌组织Bax和Bcl-2水平

2.4 各组小鼠心肌组织氧化应激水平比较

与对照组比较,病毒性心肌炎组小鼠心肌组织ROS水平增加,SOD水平降低(均P<0.05)。MitoQ用药组小鼠随着MitoQ剂量的增加,ROS水平逐渐降低,SOD水平逐渐增高(均P<0.05)。见表3。表明MitoQ能够改善病毒性心肌炎小鼠心肌组织氧化应激。

表3 各组小鼠心肌组织ROS和SOD水平

2.5 各组小鼠血清TNF-α、IL-6水平比较

与对照组比较,病毒性心肌炎组小鼠血清TNF-α、IL-6水平均增加(均P<0.05);而相较于病毒性心肌炎组,MitoQ治疗组小鼠血清TNF-α、IL-6水平随MitoQ浓度的增加呈剂量依赖性降低(均P<0.05)。见表4。提示MitoQ能够抑制病毒性心肌炎小鼠心肌炎性反应。

3 讨论

病毒性心肌炎多发于儿童以及40岁以下青年,寻找能够有效抑制病毒感染导致的病毒性心肌炎的药物也具有重要意义[9]。本研究通过实验证实了线粒体靶向药物MitoQ能够抑制病毒性心肌炎小鼠心肌损伤并且减少炎性反应。

本研究首先通过CVB3感染的方式构建了病毒性心肌炎小鼠模型,之后又使用MitoQ对小鼠进行治疗,发现MitoQ能够改善心肌炎小鼠心肌组织病理损伤。cTnI和BNP是心肌损伤标志物,被证实与心功能情况有关[10,11]。而本研究使用MitoQ干预病毒性心肌炎小鼠后,小鼠血清cTnI、BNP 水平降低,这也提示MitoQ对心肌损伤的改善作用。

心肌细胞在人体中属于不可再生细胞的一种,因此其凋亡程度与心功能也存在密不可分的关系,抑制心肌细胞凋亡对于心脏保护具有十分重要意义[8]。本研究对各组小鼠心肌组织中凋亡相关因子的蛋白表达进行检测,发现病毒性心肌炎小鼠心肌组织中凋亡相关因子Bax的表达显著上调而凋亡抑制因子Bcl-2水平被抑制,提示了MitoQ对病毒性心肌炎小鼠心肌细胞凋亡的改善作用。

MitoQ作为一种线粒体靶向抗氧化剂,其发挥作用的重要途径就是通过自由穿透线粒体,抑制ROS水平从而实现抗氧化和抑制疾病进展的作用[12]。本研究对各组小鼠心肌组织氧化应激水平进行检测发现相较于病毒性心肌炎小鼠,MitoQ能够抑制ROS水平增加,促进抗氧化因子SOD水平提高。另外炎性因子检测结果也证实了MitoQ在抑制小鼠血清炎性因子中的作用。

综上所述,本研究证实了MitoQ在改善病毒性心肌炎小鼠心肌组织损伤,抑制氧化应激和炎性反应中的价值,对于病毒性心肌炎的治疗具有重要意义。