分心木水提物对大鼠慢性非细菌性前列腺炎的作用

刘 蓉,张 伟,陈雪洁,肖朝江,沈 磊,田新雁,姜 北

(1.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室,云南 大理 671000;2.大理大学 药学院,云南 大理 671000; 3.大理大学 基础医学院,云南 大理 671000)

0 引 言

慢性非细菌性前列腺炎(Chronic Non-bacterial Prostatitis,CNP)是前列腺炎综合征中最常见的类型,被认为是50岁以下男性泌尿生殖系统疾病中的常见病、多发病[1],主要表现为下腹部、会阴部疼痛或盆腔不适,常常伴随着尿频、尿急、尿痛、尿路阻塞、性功能障碍、抑郁等症状[2-3].目前临床上供选择的药物有非甾体类抗炎药、α-肾上腺素能受体阻断剂、抗生素类等;如并发有焦虑、抑郁等心理问题的CNP患者,可选择服用抗焦虑或抗抑郁药物[4-5].由于西药在前列腺炎的治疗上主要以缓解症状为目的,缺乏特异性,远期疗效并不理想,而中药的多成分多靶点可在前列腺炎的保护与治疗上发挥着重要作用,因此日益受到重视[6].

分心木(Diaphragma Juglandis Fructus,简称DJF)又名胡桃隔,为胡桃科胡桃属植物核桃(JuglansregiaL.)果实内的木质中隔,是核桃产品加工过程中主要的副产物.云南大理为我国核桃主要产地,所属漾濞县因盛产著名的漾濞泡核桃而被誉为“中国核桃之乡”,每年分心木产量巨大,但开发应用十分有限,已不同程度地制约了核桃产业与社会经济的健康发展.根据传统药用记载,分心木具有固肾涩精的功效,主治遗精、滑精、遗尿、尿血、淋病、带下等多种泌尿生殖系统疾病[7-8].据文献报道,分心木中分离得到的部分化合物表现出显著的抗炎效果[9-10],且本课题组前期实验也发现分心木水提取物具有较好的抗炎活性.基于分心木固肾涩精的传统药用记载和现代抗炎作用研究,本课题拟用现代药理学方法对分心木治疗CNP大鼠的作用及其机制进行研究,为进一步开发利用分心木药材资源创造条件.

1 材料与仪器

1.1 细胞株及动物

巨噬细胞株RAW264.7,武汉普诺赛生命科技有限公司;SD大鼠,SPF级,雄性,体质量180～220 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,实验动物生产许可证号SCKY(湘)2019-0004.动物实验符合3R原则,且经大理大学伦理委员会审核通过.

1.2 样品及主要试剂

1.3 仪器

Varioskan LUX功能酶标仪,美国赛默飞世尔科技公司;CFX96实时荧光定量PCR仪,美国BIO-RAD公司;N60核酸蛋白测定仪,美国IMPLEN公司;T6新世纪紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;Tissuelyser-L多样品组织研磨仪,上海净信实业发展有限公司;HC-301R高速冷冻离心机,安徽中科中佳科学仪器有限公司;0408-2型台式低速离心机,上海医疗器械(集团)有限公司;MCO-18AIC CO2孵育箱,日本三洋电器公司;大鼠独立通气笼,苏州市苏杭科技器材有限公司.

2 方法

2.1 分心木供试样品的制备

取干燥的分心木样品,粉碎,加入适量蒸馏水(1∶6,w/v),100 ℃ 回流提取3次,趁热过滤,合并滤液,浓缩冻干,得分心木水提取物(DJF-W).部分分心木水提取物以D101型大孔树脂柱层析进行粗分划段,依次用0、50%、100%甲醇-水洗脱,每次洗脱至样品不再增加,分别得D101大孔树脂水洗脱部位(D101-1)、50%甲醇洗脱部位(D101-2)、100%甲醇洗脱部位(D101-3)样品.

2.2 分心木总黄酮、总多酚和总多糖的含量测定

总黄酮和总多糖含量测定参照中国药典2020版中的方法进行[11],总黄酮以芦丁为标准品,通过亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠显色进行测定;总多糖以无水葡萄糖为标准品,通过硫酸-蒽酮法进行测定.总多酚含量测定参照国家标准中的方法进行[12],以没食子酸为标准品,采用福林酚试剂法进行测定.

2.3 LPS诱导巨噬细胞RAW264.7炎症模型的建立

巨噬细胞RAW264.7混悬于含10%胎牛血清、1%链霉素和青霉素的高糖DMEM培养基中,置于 37 ℃、5% CO2培养箱中培养.取对数生长期细胞以5×104个/孔的密度接种到96孔板内,放入培养箱培养 24 h 后,弃去培养液,PBS清洗一遍,加入 100 μL 含不同浓度药物的培养基,正常组和模型组加入等体积的正常培养基,每组8个复孔.孵育 30 min 后,正常组(非LPS诱导组)加入 100 μL 正常培养基,模型组和实验组加入 100 μL 含LPS(1 μg/mL)的培养基,继续孵育 24 h 后,收集上清液测定一氧化氮(NO)含量.NO含量测定参照一氧化氮试剂盒说明书进行.

2.4 慢性非细菌性前列腺炎大鼠模型的建立

参照文献[13-14]的方法建立CNP大鼠模型.30只雄性SD大鼠,适应性喂养 7 d,随机分组,每组6只.具体实验步骤如下:所有大鼠腹腔注射10%水合氯醛(剂量:0.4 mL/100 g),麻醉,备皮,于下腹正中切口,棉签轻轻挑起膀胱,暴露附于膀胱颈外侧的前列腺,模型组和实验组于前列腺双侧腹叶各注入 100 μL 的1%角叉菜胶生理盐水溶液,假手术组注射等体积的生理盐水.随后,逐层缝合腹壁肌肉皮肤,消毒,放回鼠笼,自由饮食.术后第 4 d,假手术组和模型组灌胃蒸馏水,阳性药组灌胃前列康混悬液,分心木组灌胃分心木水提物,连续给药 10 d.末次给药后 1 h,称量体重,麻醉,腹主动脉取血,室温静置 30 min,3 500 r/min 离心 15 min,取上清液于 -20 ℃ 保存备用;同时剖取前列腺组织,在生理盐水中剥离多余的脂肪和组织,吸干水分,称重后,选取一部分组织做病理切片,另取一部分组织用组织研磨仪制成10%的组织匀浆,10 000 r/min 离心 10 min,取上清液于 -20 ℃ 保存备用.

2.5 相关指标检测

1) 前列腺指数(PI):PI=前列腺湿重(g)/体重(g)×100%.

2) 前列腺组织病理切片:按照常规病理切片制作、染色步骤,将一部分前列腺组织在4%多聚甲醛固定液中固定至少 24 h,脱水,石蜡包埋,制片,H&E染色,镜下观察其病理组织学变化.

3) 按照试剂盒说明书步骤,采用Elisa法测定CNP大鼠血清中PSA、TNF-α、PGE2的含量;采用比色法测定前列腺组织中MDA的含量.

速生桉树春、夏、秋三季都可以进行种植，但在春季雨后进行的种植成活率最高。因此，造林技术中选择春季雨后种植应更受到重视，在气温、土壤、空气都满足速生桉树生长的最适宜条件下的种植能够满足速生桉树的生长效益，也能够提高其经济效益。

4) RT-PCR法测定前列腺组织中COX-2和Nrf2的mRNA表达水平,以GAPDH为内控基因,用2-ΔΔCt方法计算相关基因表达量.引物序列如表1,由生工生物公司合成.

2.6 数据处理

数据采用mean±SD表示,SPSS 20.0软件进行统计学单因素方差分析(One-Way ANOVE),比较组间差异,P<0.05认为差异有统计学意义.

3 结果与分析

3.1 分心木水提物及各部位样品总黄酮、总多酚和总多糖的含量测定

对分心木水提物及大孔树脂各洗脱部位中的总黄酮、总多酚和总多糖进行含量测定,结果如表2所示,各部位成分含量差异显著,其中大孔树脂50%甲醇洗脱部位总黄酮、总多酚和总多糖含量均为最高,较分心木水提物各成分含量均有显著的提高.

表2 分心木水提物及各部位几种类型成分含量

3.2 分心木水提物及各部位对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7炎症反应的影响

分心木水提物及各部位对脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7释放的NO含量分析结果如表3所示,与正常组比较,LPS刺激之后,模型组的NO含量明显升高(P<0.01);与模型组比较,分心木水提物及各部位均能不同程度地降低NO的含量,但是仅分心木水提物差异有统计学意义(P<0.01).

表3 分心木水提物及各部位对脂多糖诱导巨噬细胞RAW264.7释放NO的影响

3.3 分心木水提物对CNP大鼠PI和PSA的影响

分心木水提物对CNP大鼠PI和PSA的影响结果如表4所示.与假手术组相比,模型组PI(P<0.05)和血清中PSA的水平(P<0.01)均显著升高.与模型组比较,分心木水提物高、低剂量组均未能显著降低CNP大鼠的PI水平;但是分心木水提物高剂量组(1 g/kg)能显著降低CNP大鼠血清中PSA的水平(P<0.01).

表4 分心木水提物对CNP大鼠PI和PSA的影响

3.4 分心木水提物对CNP大鼠前列腺组织的病理学影响

分心木水提物对大鼠前列腺组织病理学影响如图1所示.光学显微镜下观察,假手术组大鼠前列腺组织腺泡形状规则,呈单层立方或者柱状排列,基底膜完整,未见明显水肿及炎性细胞浸润.模型组大鼠前列腺组织可见大量炎性细胞浸润,前列腺明显水肿、间质疏松,腺泡形状不规则,腺体上皮褶皱增加,部分基底膜被破坏.与模型组比较,分心木水提物高(1 g/kg)、低(0.5 g/kg)剂量组,均能不同程度地降低大鼠前列腺组织水肿及炎性细胞浸润,减轻组织的炎症反应,但疗效均较前列康组略差.

(a)假手术组 (b)模型组 (c)前列康组

(d)分心木水提物高剂量组(1 g/kg) (e)分心木水提物低剂量组(0.5 g/kg)图1 大鼠前列腺组织病理切片(×200,标尺:100 μm)Fig.1 Pathological section of rat prostate (×200,ruler:100 μm)

3.5 分心木水提物对CNP大鼠血清学指标(TNF-α、PGE2)的影响

对CNP大鼠血清中TNF-α、PGE2的含量进行测定,结果如表5所示.与假手术组比较,模型组大鼠中TNF-α、PGE2水平均显著升高(P<0.01);与模型组比较,前列康组、分心木水提物0.5、1 g/kg 组均能显著降低CNP大鼠血清中TNF-α、PGE2的水平(P<0.01).

3.6 分心木水提物对CNP大鼠组织中MDA、Nrf2、COX-2的影响

对CNP大鼠前列腺组织中MDA的含量以及Nrf2、COX-2的基因表达水平进行测定,结果见表6.与假手术组比较,模型组大鼠前列腺组织中MDA和COX-2的水平均显著上升(P<0.01),Nrf2的基因表达水平显著降低(P<0.01);与模型组比较,前列康组、分心木水提物 0.5 g/kg 组能显著降低组织中MDA的含量以及COX-2的基因表达水平(P<0.01),分心木水提物 1 g/kg 组能一定程度都升高Nrf2基因的表达水平,尽管统计学差异不显著(P>0.05).

表5 分心木水提物对CNP大鼠血清学指标的影响

(a) Nrf2 mRNA的扩增曲线 (b) COX-2 mRNA的扩增曲线 (c) GAPDH mRNA的扩增曲线

(d) Nrf2熔解曲线 (e) COX-2熔解曲线 (f) GAPDH熔解曲线图2 CNP大鼠前列腺组织中Nrf2、COX-2和GAPDH mRNA的扩增曲线及熔解曲线Fig.2 Amplification curve and melting curve of Nrf2,COX-2 and GAPDH mRNA in prostate tissue of CNP rats

表6 分心木水提物对CNP大鼠组织中MDA、Nrf2、COX-2的影响其中mRNA n=3)

续表6

4 讨 论

分心木水提物通过D101型大孔树脂柱层析进行粗分划段后,对几类成分进行含量测定,结果显示,分心木水提物及各部位之间所含的成分类别以及含量存在明显差异.通过LPS诱导建立巨噬细胞RAW264.7炎症模型,检测分心木水提物及各部位的抗炎活性,实验结果显示,只有分心木水提物能够显著性降低NO的含量,说明水提物抗炎效果优于其他三个洗脱部位.然而,由于50%甲醇部位总黄酮、总多酚和总多糖含量最高,但并未显示最好的降低NO活性,因此,分心木抗炎活性应该还与所含有的其他类型成分有密切关系,其治疗作用应是多成分协同作用的结果,这些结果也在一定程度上验证了民间分心木泡水服用的合理性.为此后续体内实验,仅选择分心木水提物作为研究对象.

本研究以PI和PSA两个指标的升高作为CNP模型建立成功的标准[13-14].前列腺炎会引起前列腺的组织水肿,PI升高.PSA是由前列腺腺泡及导管分泌的一种丝氨酸蛋白酶,直接分泌到前列腺导管内,正常情况下前列腺与周围有屏障隔离,所以仅有微量的PSA进入血液循环,但当前列腺出现炎症或增生等病变时,就会引起PSA在血液中不同程度的升高,血清PSA水平与炎症的严重程度、前列腺体积密切相关[15].根据实验结果可以看出,分心木水提物能显著降低CNP大鼠血清中PSA的水平,表明分心木水提物对CNP大鼠的炎症有一定的缓解作用.

慢性前列腺炎的发病机制主要涉及病原体感染、氧化应激以及细胞因子与机体自身免疫等因素[16-17].CNP的发生发展涉及到多种炎症因子,TNF-α是机体受到损伤时由巨噬细胞产生的促炎因子,可加速多种炎症因子的聚集和释放,并且能促进巨噬细胞释放前列腺素、白三烯等炎症介质加重局部炎症[18-19].本实验结果显示,CNP模型组大鼠血清中TNF-α水平明显升高,当用不同剂量的分心木提取物进行治疗干预后,血清中的TNF-α水平降低,表明其具有抑制炎症因子释放的作用.

花生四烯酸代谢途径是重要的炎症通路,炎症发生时,COX-2的表达升高,导致PGE2的合成增加,引起局部疼痛和血管扩张,促进炎性反应[20-21].同时,PGE2的上升能够诱导线粒体的损伤,促进氧自由基对上皮细胞造成损伤[22-23].实验结果显示,CNP模型组大鼠血清中PGE2水平和组织中COX-2的基因表达水平明显升高,当用不同剂量的分心木水提物进行干预后,血清中的PGE2含量和组织中COX-2的基因表达水平降低,说明其抗炎作用可能与COX-2/PGE2通路有关.

氧化应激也是CNP发展的重要机制,氧化应激反应是继发于炎症反应之后的前列腺组织损伤[24],氧自由基过度产生会导致膜脂质过氧化,而MDA为膜脂质过氧化的终产物[13].Nrf2作为细胞对抗内外源性物质产生氧化应激的重要转录因子,能特异性的结合抗氧化反应元件(ARE)序列,调控ARE依赖的下游基因,Nrf2/ARE作为最重要的抗氧化信号通路之一参与机体的自我保护[25-26].实验结果显示,CNP模型组大鼠前列腺组织中Nrf2的基因表达水平明显降低,MDA的含量明显升高,当给分心木水提物进行干预之后,能增加Nrf2的基因表达水平,减少前列腺组织中MDA的含量,表明分心木水提物对CNP的治疗作用可能与激活Nrf2介导的ARE通路有关.

5 结 论

分心木可能以多成分协同作用的方式、通过抑制炎症因子的释放和抗氧化对CNP大鼠起到治疗作用,其机制应该与COX-2/PGE2及Nrf2两条信号通路有关.本研究结果也验证了分心木在民间用于泌尿生殖系统相关疾病的合理性,为分心木后续在泌尿生殖系统保健方面的开发利用提供实验依据.