玉米种子萌芽过程中污染性微生物多样性鉴定

肖婉钰, 王 盼, 孙艺嘉, 周贤玉, 任海龙, 邹集文, 张 晶, 黄江华, 许东林

(1.广州市农业科学研究院,广东广州 510000; 2.仲恺农业工程学院农业与生物学院,广东广州 510000)

玉米是我国种植面积广泛的重要粮食作物之一,为了确保在玉米种植业中使用优良种子,实现优产、高产,用种前需要对玉米种子进行质量检验。发芽率是反映种子质量的1个关键指标,在种子质量监督检验工作中是必检项目。根据GB/T 3543.4—1995《农作物种子检验规程 发芽试验》,农作物种子发芽率的测定历时7～21 d(玉米为 8 d),在此过程中,常见受检种子和/或幼苗因本身携带各类病原菌[1]或受到环境中微生物污染而出现发霉、腐烂的现象,可能对测定结果的准确性产生较大影响,需要重新测定。分析玉米种子样品萌芽过程中可能出现的污染性微生物种类,对于在测定发芽率前对种子样品进行适宜的预处理(如消毒、灭菌等)、提高种子质量检验结果的准确性和工作效率、筛选健康种子、预先避免玉米种传病害的发生等均具有参考价值。本研究挑选广东地区种子质量监督工作中抽检的8份玉米种子样品,采用微生物培养与高通量测序分析等方法对其在发芽率测定过程中产生的污染性微生物种类进行鉴定,以期为玉米种子质量控制及种传病害预防提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 种子样品

供试的8份玉米种子来自2021年广东省种子质量监督检验中的抽检样品,其编号分别为ym1(华美甜9号)、ym2(华美糯7号)、ym3(耕耘白糯)、ym4(华旺甜7号)、ym5(正大999)、ym6(极峰30)、ym7(桂单166)、ym8(华美甜168)。上述种子样品均来自广州市辖区内,系市售的小包装商品(每包500 g或1 000 g),包装完好,种子无包衣,开始本试验时保质期限均大于6个月,抽样后于20 ℃干燥保存。

1.2 种子萌芽及污染性微生物样品的采集

在2021年5月,按照GB/T 3543—1995《农作物种子检验规程》中的要求,在广州市农业科学研究院实验室中对上述ym1～ym8种子样品进行净种子分离和发芽率试验。每份样品随机选取400粒净种子(100粒×4个重复),夹在2层湿润的发芽纸之间,随后将其放入发芽盒中(每盒1个重复),在光照培养箱(25 ℃,光—暗周期为12 h—12 h)内保湿培养8 d后,参照GB/T 3543.4—1995《农作物种子检验规程 发芽试验》中的方法测定发芽率(正常幼苗数/置床种子总数×100%),并统计污染率(出现发霉状污染物的种子数或幼苗数/置床种子总数×100%)。萌芽结束后,在生物安全柜中用灭菌的金属样品勺将发芽盒中的幼苗根部和/或发芽纸上出现的发霉样污染物刮下,将每份种子样品(4个发芽盒)中的污染物合并溶解于20 mL灭菌双蒸水中,所得溶液保存于 -20 ℃ 备用。在本研究中,将ym1～ym8在萌芽过程中产生的污染性微生物命名为样品YM1～YM8。

1.3 污染性微生物种类的鉴定

将染污物样品YM1～YM8经干冰运输交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行总DNA提取、PCR 扩增与高通量测序。用FastDNA Spin Kit for Soil 试剂盒(美国MP Biomedicals)对污染性微生物菌液进行总DNA的提取,并用NanoDrop 2000分光光度计进行纯度与浓度检测。以所得总DNA为模板,采用真菌ITS1区通用引物5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′与 5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′对样品中所含的真菌DNA进行扩增,采用细菌16S rDNA V3～V4区通用引物5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′与5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′(H=A/C/T,V=A/C/G,W=A/T)对样品中所含的细菌DNA进行扩增。所得扩增产物按照标准流程进行文库的构建并通过Illumina Miseq/Hiseq平台进行高通量测序。测序完成后,对所得原始数据进行去除接头及引物序列、paired-end序列拼接等处理,再用barcode标签序列识别并区分各样品的测序结果,最后对序列数据进行质控过滤,得到各样品的有效测序数据。用Usearch v11软件(http://drive5.com/usearch/manual/)剔除重复序列,按照相似性≥97%的非重复序列为1个out(operationaltaxonomic units),对所有非重复序列(不含单序列)进行OTU 聚类,获得各个OTU的代表序列。通过GenBank BLAST比对,按相似度>90%且coverage>90%的标准筛选用于后续分类的OTU序列(不满足该条件的序列被归为“unclassified”),再用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列,进行分类学分析,鉴别每个OTU对应的物种分类信息。细菌16S rDNA片段采用RDP classifier比对RDP数据库,真菌ITS片段序列使用BLAST比对UNITE数据库,最终分别在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)、属(genus)、种(species)等分类阶元上统计各样本的群落组成。用Mothur软件计算各样品中微生物群体的丰富度指数(Chao1与ACE)、多样性指数(Shannon与Simpson)及测序文库覆盖率(coverage)。

2 结果与分析

2.1 种子样品的发芽率及污染情况

置床培养8 d后,样品ym1～ym8的发芽率为80%～92%,其中2个样品(ym1=80%,ym2=82%)的发芽率低于GB 4401.1—1996《粮食作物种子——禾谷类》中规定的国家质量标准(85%),但在使用容许误差(5%)内可判定为合格。8个样品的发霉率为4%～15%,其中ym1、ym2、ym4的污染率均大于10%,表现为死种子或腐烂幼苗。此结果表明,污染性微生物可对部分种子样品的发芽率测定结果产生较大影响,甚至有可能影响合格性判定的准确性。

2.2 污染性细菌的群落结构

通过对测序结果进行序列优化和OTU聚类,分别从8份玉米种子萌芽过程中产生的污染性微生物样品(YM1～YM8)中获得41 467～61 104条细菌DNA序列,共计68～231个OTU,8个样品共获得268个不同的细菌OTU。用RDP classifier对这些OTU进行分类学分析,结果表明,8个样品中所含有的分类地位明确的细菌共来自11门、22纲、36目、62科、119属(表1)。其中,来自YM3和YM4的OTU数量及鉴定出的各级分类阶元数量均显著少于其他6个样品。根据Shannon指数的计算结果,YM2的细菌群体多样性最高,YM8的多样性最低,二者均与其他6个样品间有较大差异;根据Chao1及ACE指数的计算结果,YM2的细菌群落丰富度最高,YM1次之,YM3和YM4的群落丰富度最低(表1)。整体上看,样品的细菌群落丰富度越高,其包含不同分类阶元的数量越多。

表1 玉米发芽率测定过程中污染性微生物群落的多样性

在门水平上,各样品的平均相对丰度大于1%的细菌有3个门,分别是变形菌门占比为76.8%,拟杆菌门占比为21.3%,厚壁菌门占比为1.2%,其中在YM3、YM5中变形菌门相对丰度高达97.9%～98.7%,在YM6中,拟杆菌门占53.6%,变形菌门占45.6%。此外,装甲菌门(Armatimonadetes)细菌仅在YM2中检测到,相对丰度为3.5%,这部分细菌属于菌毛单胞菌纲、菌毛单胞菌目(Fimbriimonadales)、菌毛单胞菌科(Fimbriimonadaceae)、菌毛单胞菌属(Fimbriimonas)。在纲水平上,从8个样品中共鉴定到8个相对丰度>1%的细菌纲,其中6个样品中大部分(57%～88%)细菌来自γ-变形菌纲,而YM2、YM6中的细菌分散于不同的纲(表2)。

表2 玉米发芽率测定过程中的污染性微生物纲水平的组成及相对丰度

从8个污染物样品中共鉴定到相对丰度大于1%的细菌有12目、19科,它们在各样品中的相对丰度见图1。可以看出,在目水平上,假单胞菌目(Pseudomonadales)在4个样品中为优势类群(占36.2%～79.7%),肠杆菌目(Enterobacteriales)在2个样品中为优势类群(相对丰度>55%),黄杆菌目(Flavobacteriales)在1个样品中为优势类群(占35.3%);而YM2中的细菌较分散,其中有87%来自伯克氏菌目(Burkholderiales)、鞘脂杆菌目(Sphingobacteriales)、红螺菌目(Rhodospirillales)、肠杆菌目、噬纤维菌目(Cytophagales)、假单胞菌目、黄杆菌目、根瘤菌目(Rhizobiales)等8个目(占6.7%～17.1%)(图1)。在科水平上,在不同样品中占比>35%的优势类群有假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、莫拉氏菌科(Moraxellaceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)等(图1)。

由图2可以看出,在属水平上,假单胞菌属(Pseudomonas)在3个样品(YM1、YM4、YM8)中为优势类群,占36%～77%;泛菌属(Pantoea,占52.4%)、金黄杆菌属(Chryseobacterium,占35.0%)、不动杆菌属(Acinetobacter,占52.5%)分别为YM5、YM6、YM7中的优势类群。此外,鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、伯克氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、克雷白氏杆菌属(Klebsiella)、固氮螺菌属(Azospirillum)、Luteibacter等属在部分样品中含量较高(8%～18%)。上述10个属在8个样品中的平均相对丰度为1%～24%。

2.3 污染性真菌的群落结构

基于测序结果的OTU聚类结果显示,8个玉米种子污染物样品(YM1～YM8)获得了15 844～63 383 条真菌DNA序列,共计33～92个OTU,8个样品共获得115个不同的真菌OTU。采用RDP classifier对这些OTU进行分类学分析, 结果(表1)表明,8个样品中含有的分类地位明确的真菌共来自3门、16纲、27目、53科、71属、93种。根据Shannon指数的计算结果,YM5真菌群体的多样性最高,YM2的多样性最低。根据Chao1、ACE指数的计算结果,YM4的细菌群落丰富度最高,YM6次之,YM5的细菌群落丰富度最低。

在门水平上,从8个样品中共鉴定到3个真菌门:子囊菌门(Ascomycota)、毛霉菌门(Mucoromycota)、担子菌门(Basidiomycota),平均相对丰度分别为57.67%、41.59%、0.67%。子囊菌门在其中5个样品(YM1、YM3、YM5、YM7、YM8)中的相对丰度高达69.5%～99.7%,而毛霉菌门(占58.6%～98.0%)在另外3个样品中为优势类群,担子菌门在YM5中占4.4%,在其余7个样品中的含量均不足0.3%。在纲水平上,从8个样品中共鉴定到8个相对丰度>1%的真菌纲,其中粪壳菌纲(Sordariomycetes,占56.4%～93.2%)在YM1、YM3、YM8中为优势类群,毛霉菌纲(Mucoromycetes,占58.6%～98.0%)为YM2、YM4、YM6中的优势类群,散囊菌纲(Eurotiomycetes)在YM7中的相对丰度高达93.4%,而YM5中的真菌分散于不同的纲中(表2)。在目、科水平上,毛霉目(Mucorales)及其下属的根霉科(Rhizopodaceae)在样品YM2与YM6中,肉座菌目(Hypocreales)及其下属的肉座菌科(Hypocreaceae)在YM8中为绝对优势类群(相对丰度为92%～98%),根霉科在YM4中为优势类群(占58.6%);散囊菌目(Eurotiales)在YM7中占93.3%,由其下属的曲霉科(Aspergillaceae,占55.2%)、毛刷囊菌科(Trichocomaceae,占38.1%)组成;在其余4个样品中,也是上述3个目的丰度最高(图3)。此外,丛赤壳科(Nectriaceae)在样品YM1、YM3中为优势类群,占56%～60%。

在属水平上,根霉属(Rhizopus)、赤霉属(Gibberella)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、篮状菌属(Talaromyces)在8个样品中的平均相对丰度(6%～41%)排前5名,它们是部分样品中的优势类群(图4)。其中根霉属及其下属种少根根霉(R.arrhizus)在YM2中相对丰度均为98%,在YM6中的相对丰度均为95%;木霉属在YM8中占92%,其下属种棘孢木霉(T.asperellum)在该样品中的相对丰度为89%;赤霉属及其下属种藤仓赤霉(G.fujikuroi)在YM1中均占59%,在YM3中均占56%;青霉属、篮状菌属在YM7中分别占46%、38%,其下属种草酸青霉(P.oxalicum,相对丰度45%)、当归篮状菌(T.angelicus,相对丰度37%)在该样品中是这2个属的绝对优势种。

3 结论与讨论

本研究对8份市售玉米种子样品在发芽率测定过程中产生的污染性真菌与细菌群体进行了分子鉴定,结果发现了来自11门、119属的细菌,以及来自3门、71属的93种真菌,表明玉米种子上的污染性微生物具有丰富的多样性。玉米种子的带菌性有多种鉴定方法[1],前人多将种子洗涤液涂布于培养基(如PDA、LB等固体培养基)上或将种子置于培养基上进行微生物分离培养[2-4],亦有采用PCR或免疫学方法进行玉米病原菌检测的报道[5-7]。但是培养基未必适合所有种类的微生物生长,且不同微生物之间可能存在营养竞争或相互拮抗,群体中相对含量较低的微生物种类难以获得培养,PCR及免疫学检测只能鉴定特定的微生物种类。本研究采用对玉米种子和/或幼苗周围产生的发霉状污染物进行高通量测序的方法,可对玉米种子携带的微生物种类“能检尽检”,充分揭示其群体的多样性,尤其是关于玉米种子携带细菌的多样性研究甚少,本研究结果丰富了此方面的知识。此外,本研究共鉴定了玉米种子在长达8 d(经过种子萌发与幼苗生长初期)的发芽率测定过程中产生的污染性微生物,较之仅鉴定种子初始(萌发前)携带的微生物种类的研究,对于探明影响玉米种子发芽率结果的因素,为种子检验制订质控措施更具有参考意义。本研究结果表明,微生物污染可能会影响玉米种子发芽率的合格性判定。在测定试验之前应先对种子进行消毒处理(如用次氯酸钠处理、加热处理[8]),至于不同的消毒措施能杀灭哪些污染性微生物,对发芽率测定结果有何影响,乃至是否应把消毒后再进行测定所得的结果视为更准确的结果,这些问题均有待进一步研究。

本研究从玉米种子污染物中鉴定到假单胞菌属、泛菌属、金黄杆菌属、不动杆菌属等细菌优势类群。其中假单胞属中的茄青枯假单胞菌(P.solanacearum)、丁香假单孢菌(P.syringae)是常见的植物病原细菌[9-11],后者可侵染玉米等禾谷类作物[12],且有报道表明,P.lapsa、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)等可引致玉米细菌性茎腐病[12-13];另一方面,荧光假单胞菌(P.fluroscens)是可拮抗多种植物病害的生防菌[14-15]。泛菌属中的成团泛菌(Pantoeaagglomerans)可侵染人类及动植物[16],国内有报道称,该菌可引致玉米细菌性干茎腐病且可经种子传播[17],而该属的另一个种斯氏泛菌(Pantoeastewartii)为另一种种传病害玉米细菌性枯萎病的病原[18]。由于根据细菌16S rDNA序列难以准确鉴定到种,尚不明确本研究中种子携带的假单胞菌与泛菌是否为玉米病原菌,但对种子进行消毒处理可以防止潜在玉米病害的传播。有研究发现,金黄杆菌属是玉米根系微生物组的模式细菌群落之一,具有抑制玉米苗枯病的生防效果[19],不动杆菌属亦是植物病害的拮抗菌,可来自土壤或植物根组织内部[20-21]。

本研究从玉米种子污染物中鉴定到的优势真菌类群可由5个种代表。其中少根根霉又称稻根霉(R.oryzea)是一种在食品、药品及化工等领域中应用广泛的真菌[22],亦可引致多种作物病害,是玉米根腐病的病原之一[23-24];藤仓赤霉是水稻及玉米恶苗病、甘蔗梢腐病等多种作物病害的病原[25];棘孢木霉是一种生防菌,对植物病原物有拮抗作用[26-28];草酸青霉可拮抗马铃薯霜霉菌、苹果镰孢菌等[29-30];篮状菌属是环境中广泛存在的腐生霉菌,该属中不同的种或为人、动物的条件致病菌,或为食品工业中的污染物,部分种分布于植物叶际,可作于生物防治多种土壤植物病原真菌[31],但是目前关于当归篮状菌的生物功能未见报道。其他常见的种子携带玉米病原真菌属如曲霉属(Aspergillus)、镰孢属(Fusarium)、链格孢属(Alternaria)等[1,3-4]在本研究中亦有检出,但含量很低。本研究鉴定到的优势细菌与真菌类群中既有植物病原菌也有生防菌,研究它们在田间生境中的共存与互作,将有助于深入了解相关植物病害的流行规律,为病害防治提供有益线索。