不同类型及不同品种百合的杂交亲和性与胚挽救

周 敏, 赵秋燕, 张 迪, 魏春梅, 陶宇蝶, 黄美娟, 黄海泉

(西南林业大学园林园艺学院/国家林业和草原局西南风景园林工程技术研究中心/云南省功能性花卉资源及产业化技术工程研究中心/西南林业大学园林园艺花卉研发中心,云南昆明 650224)

百合(Liliumsp.)是百合属植物的统称,因其花姿优美、寓意美好而受到众多消费者喜欢。目前市场上主要的百合栽培品种是亚洲百合杂种系(Asiatic hybrids)、东方百合杂种系(Oriental hybrids)、麝香百合杂种系(Longiflorumhybrids)及OT (Oriental×Trumpet hybrids)、LA(Longiflorum×Asiatic)、OA (Oriental×Asiatic )杂交种[1]。亚洲百合开花早、花色丰富、种球小且耐贮藏,但不耐高温,易感灰霉病[2];东方百合及OT百合花朵硕大且芳香,生长周期长,具有抗灰霉病的特性[3],但其花色不够丰富;麝香百合花型独特,花香清新,但是花色单一,抗病毒病的能力较差[4];LA百合综合了亚洲百合、麝香百合的特性,其花色丰富,但大多数无香。因此,为了培育综合性状优良的百合新种质,本研究以花色丰富、花大芳香、抗性作为育种目标进行百合的近缘、远缘杂交育种,探索不同百合品种间交配的亲和性规律,以期培育出具有自主知识产权的百合新品种。

杂交育种是获得百合新品种最主要的途径,但是百合杂交常表现出种间不亲和性,致使杂交失败。杂交不亲和主要包括受精前障碍、受精后障碍,其中受精前障碍主要是由于花柱的长度不同或是柱头上部和下部出现抑制作用,导致无法受精。罗建让研究发现,延迟多次授粉和蕾期多次授粉对克服百合自交障碍的效果较好,离体和切割柱头授粉对克服百合杂交过程的受精前障碍较为有效[5]。受精后障碍主要是由胚胎、胚乳及母体组织间遗传物质的不平衡引起的[6]。近年来,研究者对克服受精后障碍做了大量研究,如刘玉采用胚培养的方法成功获得了亚洲百合与LA的杂交苗[7]。马冰研究发现,用授粉第40～50天卷丹百合与亚洲百合杂交的幼胚进行整个种子培养的萌发率较高[8]。目前已有关于百合杂交亲和性[9-13]、百合杂交障碍克服[14-15]的相关报道,但是百合的遗传背景复杂,影响其杂交成功的因素诸多,需要进一步探究其内在机制。

我国是世界百合的起源中心,也是全世界百合属植物的主产地之一[16],但是我国百合育种工作起步较晚,国内通过常规育种的百合新品种非常有限,在生产上大面积推广应用的仍以国外品种为主,自主品种微乎其微,对我国百合生产的规模和效益造成了一定影响。因此,本研究用22个百合品种进行杂交,通过常规授粉和胚挽救技术,探讨杂交亲和性并解决受精障碍,以期为创制百合新种质奠定理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料购自云南滇峰花卉有限公司,于2021年4月栽种于西南林业大学树木园试验大棚内。(1)东方百合杂种系:索邦,花为粉色;所罗门之王,花为玫红色且有白色花边;阳光冰岛,花为黄色;马提尼克,花为粉色且有白色花边;西伯利亚,花为白色;八点后,花为粉色且有白色花边。(2)OT百合杂种系:紫色大理石,花为紫色;罗宾娜,花为玫红色;桌舞,花为淡粉色;闪点,花为白色且中心有玫红色斑纹;帕拉佐,花为黄色。(3)亚洲百合杂种系:小珍珠,花为粉色;小月亮,花为浅橙色;小火箭,花为红色;小图标,花为淡粉色。(4)麝香百合杂种系:白色海洋,花为白色;卡里,花为白色且中心有粉色斑纹。(5)LA杂种系:帝王黄,花为黄色;眼线,花为白色且有黑色线形花边;甜蜜赞比亚,花为白粉色且具斑纹;穿梭,花为橙色;爱马仕,花中心呈黄色,边缘为红色。均采用种植袋(45 cm×50 cm)进行种植,每袋放置10个种球。

1.2 试验方法

1.2.1 去雄及花粉生活力的测定 为了避免花朵开放后混入其他花粉,在花朵开放前1～2 d进行去雄套袋,同时为了防止组合间花期不遇,收集花药后带回实验室,置于室温下让其开裂,于4 ℃保存花粉。花粉在授粉前均采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法进行生活力的测定。

1.2.2 杂交授粉 采用常规的授粉方法进行杂交:待母本柱头分泌大量黏液时,将父本花粉涂抹于母本柱头上,并于授粉当天重复授粉2次,每个杂交组合授粉10朵,授粉后挂牌并标明母本、授粉日期。授粉后第7天开始观察并记录子房发育情况,第30天统计子房膨大数,计算膨大率,授粉后第60～75天采用油标卡尺测量蒴果大小,并计算干种子有胚率。子房膨大率=膨大子房数/授粉花朵数×100%;有胚率=有胚种子数/种子数×100%。

1.2.3 胚挽救技术 在笔者所在课题组前期研究的基础上,经过不断优化,筛选出的培养基配方为MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6 g/L琼脂,pH值为5.8～6.0。采用2种胚挽救技术:采收杂交后第7～30天停止发育的子房,进行消毒处理后用刀片将其切成2 mm的薄片进行子房切片培养(25 ℃暗培养60 d后取愈伤组织进行重新转接,进行光培养,培养基成分不变);采收授粉后60～75 d的子房进行幼胚培养(培养条件:光—暗周期为16 h—8 h,温度为20～25 ℃),60 d后观察蒴果成活率和生长状况。

1.3 数据处理

用SPSS 23.0对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 花粉生活力的测定

从表1可知,在不同百合品种之间,新鲜花粉生活力差异显著,其中东方百合所罗门之王的花粉生活力最高,是同杂种系索邦的1.7倍;OT百合紫色大理石的花粉生活力最高,是同杂种系闪点的1.61倍;亚洲百合小火箭的花粉生活力最高,是同杂种系小月亮的1.5倍;LA百合穿梭的花粉生活力最高,是同杂种系眼线的1.15倍。

表1 百合不同品种的花粉生活力

由图1可以看出,平均花粉生活力表现为麝香百合>东方百合>LA百合>亚洲百合>OT百合,说明在杂交育种中,麝香百合、LA百合和东方百合的花粉生活力较高,可以作为良好的父本材料,OT与亚洲百合则可作为母本材料。

2.2 百合同杂种系内不同品种杂交亲和性的比较与分析

如表2所示,不同百合品种之间系内正反交其杂交结实情况均存在一定差异。OO杂种系系内正反交除马提尼克×八点后杂交组合未获得有胚种子外,其他组合均不同程度地获得了膨大子房及有胚种子,在索邦×所罗门之王组合中,其正交组合的子房膨大率、蒴果大小分别是反交组合的2.73、1.14倍,反交组合的有胚率是正交组合的1.45倍。在索邦×西伯利亚组合中,其反交组合的子房膨大率是正交组合的1.11倍,蒴果大小、 有胚率分别是反交的1.13、2.82倍。将OT杂种系桌舞和罗宾娜进行系内正反交,发现其正交组合的子房膨大率、蒴果大小分别是反交组合的3.44、1.71倍, 但是正交组合并未获得有胚种子,反交组合的有胚率为38.48%。对AA杂种系小月亮×小珍珠而言,仅正交组合获得了有胚种子,其反交组合的子房膨大率是正交的2.22倍,且反交组合的蒴果比正交组合小7.5%。在LA杂种系甜蜜赞比亚和眼线系内的正反交组合中,仅正交组合获得了膨大子房,子房膨大率为57.14%,有胚率均为0,说明杂交的亲和性较差,存在严重的受精后障碍。综上可知,同杂种系内不同品种的杂交亲和性各不相同,其中OO杂种的系内亲和性较好,LA杂种的系内亲和性较差。

表2 不同品种间的系内杂交情况

2.3 百合不同杂种系间杂交亲和性的比较与分析

如表3所示,不同杂种系间杂交后,其杂交结实情况差异明显。以东方百合杂种系为母本与亚洲百合、OT系列和LA系列进行杂交育种,发现其子房膨大率、蒴果大小及有胚率均存在一定差异。其中在东方百合杂种系与亚洲百合杂种系的杂交组合中, 索邦×小图标的子房膨大率、蒴果大小分别是马提尼克×小月亮的2.00、1.21倍,但是有胚率比马提尼克×小月亮低92.08%。在东方百合杂种系与麝香百合杂种系的杂交组合中,马提尼克与麝香百合白色海洋、卡里的子房膨大率均为0,未获得有胚种子,说明东方百合与麝香百合之间杂交不亲和,存在受精障碍。在东方百合杂种系与OT系列的杂交组合中,所罗门之王×激情月球的子房膨大率、蒴果大小分别是马提尼克×闪点的2.00、1.58倍,仅所罗门之王×激情月球获得有胚种子,有胚率为42.42%。以OT杂种系为母本,与LA、麝香百合、亚洲百合、东方和OT杂种系进行杂交育种,发现其子房膨大率、蒴果大小及有胚率均存在一定差异。在OT系列与LA系列的杂交组合中,紫色大理石×穿梭的子房膨大率是紫色大理石×爱马仕的1.49倍,但有胚率比紫色大理石×爱马仕低90.71%。在OT系列与东方百合杂种系的杂交组合中,罗宾娜×索邦的子房膨大率是罗宾娜×所罗门之王的3.00倍,蒴果比罗宾娜×所罗门之王小8.97%,仅罗宾娜×索邦获得有胚种子,有胚率为12.12%。在OT系列与亚洲百合杂种系的杂交组合中,紫色大理石×小火箭的子房膨大率是帕拉佐×小月亮的2.22倍,蒴果比帕拉佐×小月亮小50.94%。索邦×小图标、紫色大理石×穿梭、激情月球×卡里和紫色大理石×小火箭等不同杂交组合虽然都获得了较高的子房膨大率和蒴果长宽比,但是有胚种子的获得率较低,说明其可能是胚发育不完全或受花粉刺激出现的假膨大[17]。马提尼克×闪点、罗宾娜×所罗门之王和帕拉佐×小月亮的有胚率为0,说明存在严重的受精后障碍。由此可见,不同杂种系间杂交亲和性程度各不相同,其杂交结实情况受正反交等诸多因素影响,有待进一步研究。

表3 不同品种系间杂交结果

2.4 不同胚挽救方式对幼胚成活的影响

由表4可以看出,不同培养方式对不同杂交组合幼胚的成活率影响较大。子房切片暗培养60 d后,OTOT杂交组合普拉芬多×桌舞与OA杂交组合帕拉左×小月亮的成活率达到50.00%,是罗宾娜×桌舞的4.55倍,之后将成活的幼胚转接至光下培养60 d左右,仅30 d胚龄的罗宾娜×桌舞、帕拉左×小月亮成活,成活率分别是暗培养的4.55、2.00倍。胚培养60 d左右时,OO杂种系八点后×马提尼克的萌发率最高,比所罗门之王×索邦高1.40%,比马提尼克×八点后高16.67%。AA杂种系中仅小珍珠×小月亮萌发,萌发率为65.00%。以东方百合杂种系为母本与亚洲百合、OT百合进行杂交,结果显示,马提尼克×闪点的萌发率是马提尼克×小月亮的2.18倍。

表4 不同培养方式对胚成活率的影响

由图2可知,马提尼克×白色海洋、阳光冰岛×卡里暗培养60 d左右时,子房经过初期膨大后逐渐褐化死亡;罗宾娜×桌舞和帕拉左×小月亮子房膨大且逐渐生成愈伤组织,之后转至光下培养,成功获得了幼苗。所罗门之王×索邦、马提尼克×八点后、八点后×马提尼克、小珍珠×小月亮、马提尼克×小月亮、马提尼克×闪点、罗宾娜×索邦经胚挽救后均获得了杂交苗且叶片肥厚、根系粗壮,部分组合胚挽救不成功。综上可知,不同杂交组合间均存在受精后障碍,胚挽救方式应根据不同杂交组合的胚龄来选择。

3 讨论与结论

在百合的杂交育种中,花粉生活力是评估花粉细胞活性的重要依据之一,其测定结果的准确性决定了杂交育种的成败[18-19]。本研究结果显示麝香百合和东方百合花粉生活力较高,在杂交亲本的选配中更适合作父本,但本研究表明,麝香百合作父本仅与OT百合激情月球杂交子房膨大率为85.00%,与东方百合马提尼克、阳光冰岛杂交均为0;东方百合作父母本其子房膨大率均等。与花粉生活力测定结果不一致,推测可能是因为授粉受精不仅需要有正常的雌雄配子体亲和,还与花粉发芽、花粉管生长等内外因子有关,因此在杂交授粉前,应先采用TTC染色法来快速测定花粉活性,反映花粉的存活状态,再结合花粉离体萌发法[20],以更准确地选择授粉亲本。

杂交亲本的选配是重要的因素之一,本研究对百合系内、系间杂交亲和性进行比较,发现无论是系内还是系间品种之间的杂交,杂交组合不同其结果也明显不同,正反交的子房膨大率和有胚率也存在较大差异。LA杂种系眼线与甜蜜赞比亚系内正反交,其正交亲和反交不亲和,可能与染色体间的差异[6]或细胞质遗传基因有关[21],也可能是因为LA遗传复杂,花粉育性低[17]。东方百合系列与麝香百合系列杂交均不亲和,可能是由于花柱长度及系间杂交双亲生理上的不协调造成的[6],也可能是受S基因控制的不亲和机制[22]。因此,在今后的杂交育种工作中,为提高育种成功率,应借鉴国内外百合的育种经验,将亲缘关系与同源性差异相结合,以更好地进行杂交亲本的选配。

不同的胚挽救方式对不同杂交组合幼胚的成活率影响较大[23]。本研究发现子房切片培养对于 30 d 胚龄的子房最有效,其在暗培养60 d后生成愈伤组织再进行光培养出苗率高达100.00%,与刘晓丽等对新铁炮百合品种和岷江百合杂交授粉 10～20 d的子房进行切片培养取材时间不同,说明取材时间应根据不同的杂交组合、子房膨大时间来选择[24]。60～75 d胚龄的幼胚进行适时剥离有利于胚吸收营养,提高萌发率[23],与邵杨等研究结果[25]相一致。本研究发现有部分组合虽获得有胚种子,但未萌发,与郭朋辉等研究紫斑百合远缘杂交亲和性结果[9]相似,推测其可能是因为胚和胚乳发育不良,胚挽救时间、培养基配方等多种因素造成的,但具体原因还需进一步探究。

本研究以百合不同杂种系的花色、花型、花香、抗性等方面的特点,进行杂交亲本的选配,无论是系内正反交还是系间不同品种的杂交,组合不同其杂交结果也明显不同,不同的胚挽救技术对不同杂交组合幼胚的成活率影响也明显不同。总体来看,除LA杂种系不亲和,其他杂种系系内杂交均不同程度亲和;东方杂种系与OT杂种系为母本进行系间杂交亲和性更好;不同胚龄的幼胚需要采用不同的胚挽救技术,幼胚培养比子房切片培养更容易获得杂交后代,成苗率更快。该研究初步探索了不同百合品种杂交亲和性规律,为今后百合杂交育种提供了理论参考,同时为创制百合新种质奠定了基础。