食用油过氧化值显色试纸的制备与快速测定

何连军 张宜明

（1杭州职业技术学院，浙江 杭州 310018；2浙江农林大学食品与健康学院，浙江 杭州 311300）

油脂在贮存、运输过程中常受到温度、空气、光照、水、微生物等因素影响而逐渐氧化、酸败变质。油脂氧化酸败后具有不愉快的气味及苦涩滋味，会降低油脂食物的适口性及营养价值。长期食用过氧化值超标的食物和油脂会对人体健康产生不利影响［1］。油脂的过氧化值一般以每千克油脂中过氧化物氧的克当量数表示（即毫克当量过氧化物氧/千克油），是判断油脂新鲜程度和质量等级的重要指标［2］。

目前过氧化值的检测方法主要依据《GB 5009.227-2016 食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》［3］中的碘量法。黄建东等［4］考察了碘量法的影响因素，发现试样称样量、碘化钾溶液的放置时间、环境温度、淀粉指示剂放置时间均对测定结果有较大影响。而任红英等［5］对《GB 5009.227-2016 食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》［3］中的化学滴定法和电位滴定法进行了对比研究，通过测定六种植物油的过氧化值，表明化学滴定法适用于高过氧化值的油样，电位滴定法则适用过氧化值低的样品。其他检测方法还有分光光度法［6-8］、光谱法［9-10］、荧光或化学发光法［11-12］等，其中应用不同显色体系的分光光度法应用较为广泛。于夕娟［6］应用氯化亚铁-硫氰酸钾显色体系以分光光度法测定了20 种油脂样品的过氧化值，测定结果与碘量法的结果之间无统计学差异。毕艳兰等［10］通过傅里叶近红外光谱技术，建立了适合检测油脂过氧化值的最优模型，其定标集以及验证集的相关系数均为0.995。

以上方法的测定程序步骤相对繁冗复杂，需要的化学试剂繁多使其难以满足快速简便、现场化的测定要求。而试纸比色具有现场、快速的检测特点，因此，开发新型试纸以实现油脂过氧化值的现场快速分析具有重要意义。本研究拟通过溶胶-凝胶法将二价铁离子以纳米复合物形式构筑在滤纸表面，利用油脂的过氧化性将二价铁离子转化为三价铁离子，并使其与显色剂二甲酚橙（xylenol orange，XO）反应生成橙红色配合物。通过比较滤纸上显色的深浅来表示油脂过氧化值的高低。以期为油脂过氧化值的现场快速检测提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

电子天平（可精确至0.01g，上海力辰科技公司）；铁架台、滴定管、碘量瓶、759S 紫外-可见分光光度计，上海棱光技术公司；加热板、真空抽滤装置、移液枪、具塞锥形瓶、烧杯、量筒、打孔器、DEEP professional 小型摄影棚（40cm×40cm×40cm）（浙江美诺摄影器材有限公司）。Quanta 650 扫描电子显微镜（scanning electronic microscopy，SEM）及配套元素分析系统（energy dispersive spectrometer，EDS），美国FEI公司。

1.2 材料与试剂

色拉油（金龙鱼，食品等级为一级油，购自临安永辉超市），自制废弃植物油（高过氧化值14.13 mmol·kg-1，碘量法滴定）；甲醇（优级纯），德国Meker公司；冰乙酸（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、甲苯（分析纯）、硅酸四乙酯（tetraethyl orthosilicate，TEOS，纯度大于99%）、盐酸（分析纯）、二氯甲烷（分析纯）、硫酸亚铁铵（分析纯）、硫氰酸钾（分析纯）、二甲酚橙、硫代硫酸钠（分析纯）、碘化钾（分析纯），均购自上海国药集团化学试剂有限公司。实验室用普通定量滤纸、可溶性淀粉购自上海源叶生物科技有限公司；Whatman1#定性滤纸，美国Whatman公司。将低过氧化值的新色拉油和高过氧化值的废弃油适量混合，制得不同过氧化值的油脂模拟样品。取20 µL 油脂样品加入2 mL 二氯甲烷/乙醇（二氯甲烷-乙醇溶液，V∶V=3∶2）稀释混合可得到待测油脂样品稀释液。

主要试剂配制方法如下：0.005 mol·L-1硫酸亚铁铵溶液：准确称取0.019 6 g 硫酸亚铁铵，用少量超纯水溶解，移入10 mL 容量瓶中，用超纯水稀释至10 mL刻度线。0.001 mol·L-1二甲酚橙甲醇溶液：准确称取36 mg二甲酚橙，加入50 mL 优级纯甲醇。0.035 mol·L-1硫酸亚铁铵溶液：准确称取0.686 3 g 硫酸亚铁铵，加入超纯水溶解，再加入0.68 mL 浓硫酸，边加边搅拌，将其倒入50 mL容量瓶中，用超纯水稀释至50 mL刻度线。0.1 mol·L-1硅酸四乙酯溶液：量取25 mL 无水乙醇和25 mL 甲苯，依次加入具塞锥形瓶中混合，最后加入1.116 mL 硅酸四乙酯。对照方法所需试剂包括三氯甲烷-冰乙酸混合液、碘化钾饱和溶液、淀粉指示剂、1.0 mol·L-1硫代硫酸钠溶液，均按《GB 5009.227-2016 食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》［3］标准配制。

1.3 显色试纸的组装制备

使用溶胶-凝胶法，利用硅酸四乙酯水解形成的二氧化硅将Fe2+沉积在定性滤纸上形成Fe2+掺杂纸基纳米材料。具体操作如下：将一片Whatman1#号定性试纸夹在砂芯漏斗中，依次安装好抽滤装置。先以无水乙醇冲洗试纸3 次，并持续抽真空5 min，确保试纸干燥。加入3 mL 硅酸四乙酯前体溶液（0.1 mol·L-1，甲苯∶乙醇=1∶1），停止抽滤保持浸润试纸3 min。彻底抽滤掉硅酸四乙酯溶液后，加入无水乙醇淋洗3 次。加入1 mL 硫酸亚铁铵溶液（0.035 mol·L-1）浸没试纸，使其彻底透过试纸片，再加入2 mL 硫酸亚铁铵溶液，浸没试纸3 min。彻底抽滤掉硫酸亚铁铵溶液后用无水乙醇淋洗3 次。随后再加入一定量抗坏血酸溶液处理滤纸片3 min，最后以无水乙醇冲洗抽滤5 min，即获得Fe2+固定化滤纸，干燥后用打孔器切成直径5 mm 的纸基圆片。将该试纸圆片贴在长条形试纸背板末端，形成试纸条备用。取备用试纸条，将其放置于加热板上，在每张试纸条的小圆片上分别滴加5～10 µL 一定浓度的二甲酚橙溶液，加热至干燥状态，制备成品待测试纸。

1.4 显色及灰度测定

取成品试纸条，在每张试纸条的小圆片上分别滴加1.2所述的油脂样品稀释液5 µL，反应一定时间后，将显色完成的试纸放在摄影棚中，拍摄者持手机在棚外距离试纸30 cm 处拍照记录。重复上述步骤，用ImageJ 软件处理拍摄图片，重复3 次测得灰度值，绘制灰度值与以0.1 为底的过氧化值对数之间的关系曲线。拍照记录显色情况，在经过灰度处理的图片中心部位选择待测区域，并用ImageJ 软件分析拍摄图片的灰度值。

1.5 条件优化

1.5.1 显色剂浓度的选择 在每张试纸条的显色圆片上分别滴加0.5、1.0、2.0 mmol·L-1二甲酚橙溶液5.0 µL，加热至较干燥状态得到不同显色剂含量的试纸条，一张留作溶剂空白滴加5 µL 二氯甲烷，其余在每张试纸条的小圆片上滴加5.0 µL 不同过氧化值的油脂样品稀释液，反应一段时间，观察显色情况并拍照记录。对3 组二甲酚橙浓度的显色效果进行观察，选择最佳显色剂浓度。

1.5.2 上样体积的选择 在上述显色剂浓度基础上，分别在每张试纸条的小圆片上滴加2.0～10.0 µL 油脂稀释液，反应一段时间，观察每组显色情况，拍照记录，选择最佳样品滴加体积。

1.5.3 显色时间的选择 取5支1.5 mL离心管，其中4 支离心管中分别加入200 µL 二氯甲烷和20 µL 不同过氧化值的油样，1支留作空白。取5张贴有小圆片的试纸条，一张留作空白滴加5 µL 二氯甲烷，其余在每张试纸条的小圆片上滴加5 µL溶解在二氯甲烷中的不同过氧化值的油样。分别于反应2、4、6、8、10 min 时在摄影棚中拍照记录，观察显色情况，选择最佳显色时间。

1.6 方法验证

1.6.1 线性范围和检出限 用优化后的条件对不同过氧化值的油脂样品稀释液上样检测，显色后用ImageJ软件对显色后条带进行数据分析，拟合建立平均灰度与过氧化值之间的线性关系，并对校正数据进行线性回归分析，根据线性标准曲线计算本方法的显色识别最低检出限。第一，直接通过试纸的显色情况进行分析判断；第二，采用ImageJ和颜色识别器软件对拍摄照片上的试纸进行显色分析，然后通过Excel 2016软件对测得数值和过氧化值之间的关系进行数据分析并得出相关线性图。

1.6.2 抗干扰分析 为防止油脂酸败导致不同的酸价影响试纸显色，首先直接通过试纸的显色情况进行分析判断。再采用ImageJ软件对拍摄照片上的试纸显色进行灰度值分析。

2 结果与分析

2.1 试纸制备与表征

通过溶胶-凝胶过程，可以形成不同金属离子掺杂的氧化物纳米材料［13］。将二价铁离子通过溶胶-凝胶过程沉积在滤纸表面，在电镜下可清晰观察到纤维素表面构筑成功的复合掺杂纳米材料。扫描电镜形貌及分散状态如图1所示，使用扫描电子显微镜扫描Fe2+α 纳米二氧化硅复合物滤纸，还可以得到元素分布图谱以及元素分析表格（电子附表1），可证实铁离子被有效组装在纳米二氧化硅中，形成复合材料。经过反复沉积组装，最终获得Fe2+-SiO2纳米纸基材料。

图1 Fe2+α纳米二氧化硅复合物滤纸表面形貌Fig.1 Surface of Fe2+ α SiO2 composite filter paper

2.2 检测参数与条件优化

2.2.1 最佳显色剂浓度的选择 根据均相溶液中的显色结果，改变显色剂二甲酚橙的浓度进行3组试验，在组装试纸滴加显色剂过程中，显色剂浓度分别选择0.5（A）、1.0（B）、2.0 mmol·L-1（C），显色情况如图2所示。

根据图2中的绿色情况，表明使用0.5 mmol·L-1二甲酚橙显色的颜色较浅，不同过氧化值之间的显色差异也不明显，使用更低浓度二甲酚橙进行显色将难以用软件进行分析。而使用2.0 mmol·L-1二甲酚橙显色的显色效果颜色过深，空白也呈现十分明显的黄色，并且不同过氧化值之间的显色差异也不明显。相比之下，使用1.0 mmol·L-1二甲酚橙显色呈现的显色效果最佳，不同过氧化值之间的显色差异明显，显色比较均匀。因此，最佳显色剂浓度应选择1.0 mmol·L-1的二甲酚橙溶液。

图2 不同显色剂浓度的显色情况Fig.2 The color results of different visualization agent concentration

2.2.2 最佳上样量的选择 改变溶解在二氯甲烷中油样的滴加体积进行4 组试验，滴加样品体积分别选择2.5（A）、5（B）、7.5（C）、10 µL（D），每组的显色情况如图3所示。结果表明，当滴加样品体积为2.5 µL时，显色效果不明显，不同过氧化值之间的显色差异不明显。当滴加样品体积为5 µL 时，显色效果比较明显，不同过氧化值之间呈现的显色差异也比较明显。而当滴加样品体积为7.5 µL 时，整体的显色效果较浅，并且不同过氧化值之间的显色差异不明显，后续较难用软件分析数值的差异。当滴加样品体积增加至10 µL时，显色的效果以及不同过氧化值之间呈现的显色差异也不够明显。综上，最佳样品滴加体积应选择5 µL。

图3 不同样品滴加体积的显色情况Fig.3 Visualization results for different sample loading volumes

2.2.3 最佳显色时间的选择 分别在显色2（A）、4（B）、6（C）、8（D）、10 min（E）时拍照获得的显色情况如图4所示。显色时间为2～4 min 时，整体的显色效果较好，但不同过氧化值之间的显色差异还不明显。显色时间为6 min 时，整体的显色效果较为明显，不同过氧化值之间的显色差异比较明显，但是显色尚未完成。当显色时间为8～10 min时，不同过氧化值之间的显色差异较为明显，且显色达到较为稳定的状态。因此，最佳的显色时间应该选择8～10 min。

图4 不同时间的显色情况Fig.4 Visualization results at different times

2.3 检测线性与响应

使用优化后的条件，即二甲酚橙浓度选择0.001 mol·L-1、滴加样品体积选择5 µL、显色时间选择8～10 min进行试纸显色，显色情况如图5所示。

图5 优化后的试纸显色Fig.5 Test paper colorization result under optimized conditions

进行3组平行试验，计算不同过氧化值试纸3次平行试验显色的平均灰度值，同时以MATLAB 软件做拟合得到的数据如表1所示。

根据以上数据，得到线性回归方程y= 7.537 1x+130.99，R²= 0.978 3，有较强的相关性。用优化后的条件进行试纸显色，结果表明，随着过氧化值的升高，试纸显色也逐渐加深，其显色梯度有着明显的区分度，配合标准参比色卡可以适用于现场快速分析。说明当过氧化值经过以0.1 为底数的对数处理后能与灰度值形成较明显的线性关系，但该曲线的斜率较低，这可能是由于灰度值是RGB 三基色相等时的色阶综合表现，导致该试纸不能精确反映过氧化值的变化。进一步用颜色识别器软件检测计算出的平均R 值、G 值、B 值分别与经对数处理的过氧化值做线性相关分析。根据表1 中log 以0.1 为底的过氧化值和分别测得的平均RGB 值的数值，运用Excel 2016 软件作出的关系分析图如图6所示。得到的相关系数分别为0.967 2、0.985 2、0.739 1，说明G 值与经对数处理的过氧化值之间存在较好的线性关系。经过拟合得到本试纸对过氧化值的线性范围为0.33～14.13 mmol·kg-1，最低分辨检出限为0.25 mmol·kg-1，曲线斜率达到12.86，相较于灰度值更加灵敏准确。按照《GB 2716-2018 食品安全国家标准 植物油》［14］中食用植物油卫生标准的规定，食用植物油过氧化值应不超过10 mmol·kg-1，此限值落在该曲线线性范围内，因此，该方法可以判断食用植物油的过氧化值是否超标。

图6 拟合后的过氧化值与RGB值之间的关系图Fig.6 Plot between treated peroxide values and RGB intensity values

表1 样品过氧化值与平均灰度值关系表Table 1 Relationship between sample peroxide values and mean grey values

2.4 稳定性测试和实际样品验证

前期研究发现，基于硫氰酸钾为显色剂的油脂过氧化值试纸对因油脂酸败导致的pH变化敏感，其测定结果易受到油脂不同酸价的干扰。本研究对这两种显色体系做了pH 干扰性试验。通过在同一油样溶解液中添加不同浓度的冰乙酸模拟油脂酸败后的酸价差异。用打孔器将精密pH试纸制成同等尺寸的小圆片，分别在pH 试纸和本研究制备的过氧化值试纸上滴加10 µL 模拟油样溶解液。对照标准比色卡，读出接近的pH 值，再将pH 值不同的油脂模拟溶液分别滴加到以硫氰酸钾和二甲酚橙为显色剂的试纸上，对比两种试纸受模拟酸价的影响情况，拍照记录并用颜色识别器软件测定G值。以硫氰酸钾为显色剂的试纸和以二甲酚橙为显色剂的试纸在相同过氧化值、不同pH值下的显色情况，以及用颜色识别器软件测定两种试纸显色的G值变化，测得G值随模拟酸价的变化情况如表2所示。

由电子附图1 可知，在硫氰酸钾试纸和二甲酚橙试纸上滴加相同过氧化值的溶解油样，硫氰酸钾试纸受油脂模拟酸价的影响，在试纸上的显色呈现较大差异，而二甲酚橙试纸显色差异较小。进一步结合表2 中两种试纸显色测得的G 值来看，以二甲酚橙为显色剂的试纸测得的G 值较为稳定，差异较小。参照《GB 2716-2018 食品安全国家标准 植物油》［14］，食用植物油的酸价应不超过3.0 mg KOH·g-1（约相当于表2 中pH 值4.5）。表2 结果显示，随着pH 值的增加，以硫氰酸钾为显色剂的试纸显色灰度持续增加，而以二甲酚橙为显色剂的试纸则较为稳定，受油脂酸价的影响较小，这也是当前显色方案的优势所在［15-17］。对实际样品分别用国标滴定法获得的预测值和试纸实测法结果对比见表3，说明当前方法更为耐受来自酸价的干扰。

表3 实际样品模拟测试Table 3 The detection result of real sample/（mmol·kg-1）

电子附图1 不同酸值下相同过氧化值样品在pH试纸、硫氰化钾试纸以及二甲酚橙显色试纸上的显色效果Electronic Fig.S1 The color effect of the sample with the same peroxide value under the different acid value on pH test paper，potassium thiocyanate test paper and xylenol orange test paper

表2 G值与样品模拟酸价的关系表Table 2 Relationship between green intensity values and simulated acid values of samples

3 讨论

食用油脂特别是植物源性油脂富含多不饱和脂肪酸，而环境中的三线态氧（3O2）受激发后形成的单线态氧（1O2）具有亲电性，极易对碳碳双键发生直接进攻，形成氢过氧化物［18］。在油脂加工储藏过程中，不良的储藏条件或加工方式会给油脂带来多种形式的能量，包括强烈的光能、热能等，从而诱导油脂中自由基R·的形成和积累，引发自由基链式反应［19］。氢过氧化物是油脂氧化过程中极不稳定的一种中间产物，随着氧化程度的加深而分解成醛、酮、酸、醇、环状化合物等小分子物质，同时RO·也会裂解、聚合形成异味醛类化合物［20-21］。抗氧化剂的使用有助于缓解油脂过氧化值的异常增加［22］。及时快速动态监测油脂加工过程中的过氧化值变化具有重要意义。

如前所述，近年来发展的分光光度法成为快速分析油脂过氧化值的有力手段。最早报道二甲酚橙-亚铁离子显色可见于Jiang 等［15］以及Jaffar 等的研究［16］，利用二甲酚橙-亚铁离子氧化还原法成功测出了21种植物油中所含的氢过氧化物。二价铁离子在很多相关的分析方法中被应用到，如利用Fe2+/ Ce4+的氧化还原作用基可实现精准的库伦滴定分析［23］。与均相溶液中反应不同的是，固定化后的铁离子也可以在界面上发生氧化还原传递反应。刘海弟等［24］制备了介孔二氧化硅掺杂铁离子材料，该材料在双氧水协同下可以高效催化苯酚降解。这是由于铁元素被牢固负载于多孔二氧化硅的骨架上，可以避免其在高pH值下发生的水解反应。本研究利用溶胶-凝胶还原反应形成了固定掺杂二价铁离子的纳米SiO2材料，固定化铁离子在纸基界面上与油脂过氧化物发生氧化还原反应，最终产生显色效果。所制备的铁离子掺杂复合材料不仅能适应样品溶液的pH值变化与波动，其包被材料二氧化硅和显色剂二甲酚橙也不会产生任何背景显色，这有助于铁离子在显色反应中的颜色螯合转变。因此，当前制备的介孔二氧化硅是包埋掺杂铁离子的良好材料。在优化条件下，显色剂XO 与氧化形成的Fe3+反应形成紫红色螯合物，相关显色螯合机制如图7所示。

图7 二甲酚橙与三价铁离子显色原理示意图Fig.7 Diagram of color rendering principle of xylenol orange and ferric ion

一般来说，试纸分析中的显色斑点颜色深浅度与样品的浓度存在直接相关关系。本研究采用显色斑点的颜色深浅度（灰度值）作为半定量指标。结果表明，界面显色完成后的显色斑点颜色深浅度与样品浓度之间存在相关关系，ImageJ 软件的分析结果也验证了这一点。最终优化后的纸基界面显色分析方法是一个可控的体系，表现出良好的重现性及精密度。

目前，油脂中过氧化值的检测手段以滴定法（电位滴定）为主［3，25-30］。这些常规理化方法结果虽较为精确，但操作相对繁琐，有着严苛的试验条件要求。与此类方法相比，本研究开发的试纸方法操作相对便捷，无需滴定操作即可在数分钟内完成，并可利用手机拍照完成半定量分析。同时，该试纸由无机材料构成，耐储存且较为稳定，只需适量的溶剂稀释液对粘稠的油脂样品展开稀释即可立即实现显色分析，成本较低。此外，在日常监测过程中，多条试纸同时展开显色分析可以有效提升检测的通量，可同时进行大批量样品的检测，且样品稀释后完成显色仅需10 min，这是仪器和常规滴定方法难以实现的［30］。综上，本研究开发的方法在油脂安全快速分析领域具有广泛的应用前景。

4 结论

本研究基于溶胶-凝胶策略在滤纸表面构筑了一种新型二价铁离子掺杂的纸基显色纳米材料，同时使用二甲酚橙作为显色剂构筑到试纸上，实现一步显色。随着过氧化值的升高，所制备的显色试纸显出的橙红色逐渐加深，通过颜色识别器软件分析测得的G值与经对数处理的过氧化值之间存在线性关系，相关性较强，对油脂过氧化值的线性范围为0.33～14.13 mmol·kg-1，最低分辨检出限为0.2 mmol·kg-1，相较于直接用灰度值检测更加灵敏。经显色参数优化后获得的显色试纸具有显色稳定和抗干扰性强等优势，适用于油脂过氧化值现场快速分析。