不结球白菜酵母杂交cDNA文库构建及BcFT上游调控因子筛选

徐新凤 王惠玉 米 闵 侯喜林 李 英 王建军 肖 栋 刘同坤

（作物遗传与种质创新国家重点实验室/农业农村部华东地区园艺作物生物学与种质创新重点实验室，南京农业大学园艺学院，江苏 南京 210095）

开花是植物生长发育过程中的重要一环［1］。同时，开花作为重要的数量性状之一，其调控通路错综复杂，受到各种内源性和外源性信号的调节［2-3］。目前，拟南芥开花途径的相关研究已经较为透彻，主要包括六大途径：光周期途径、春化途径、温度途径、赤霉素途径、年龄途径及自主途径［4-5］，途径之间相互交叉、相互依赖。首先，植物通过多种途径将信号传递给开花整合基因；随后，开花整合基因进一步调控其下游开花相关基因的表达，从而调节植物开花。例如，FLOWERING LOCUS T（FT）基因编码一种磷脂酰乙醇胺结合蛋白，属于PEBP 蛋白家族［6］。FT是关键的开花基因，将信号进一步传递给花分生组织，最终调控植物开花。由此可见，FT基因是植物成花网络中的关键因子［7］。

不结球白菜［Brassica campestris（syn.Brassica rapa）ssp.chinensis］是十字花科芸薹属白菜亚种中典型的开花植物，起源于我国，栽培历史悠久，是我国长江中下游地区人们最喜爱的蔬菜之一［8-9］。然而，过早开花会导致不结球白菜的营养生长受到抑制，经济价值随之降低；过晚开花则会导致不结球白菜错过最佳生长季节，商品价值受到影响。因此，平衡不结球白菜的开花时间是提高其经济价值的前提［10］。此前的研究中，通过混合分组测序分析法（bulked segregation analysis，BSA-seq）定位到了不结球白菜开花相关基因BcFT［11］。许多研究显示，在大豆［Glycine max（L.）merr.］中FT存在10 个同源基因，其中GmFT2a和GmFT5a在开花转变中起促进作用，而GmFT1a和GmFT4则抑制大豆开花［12］。在甜菜（Beta vulgarisL.）中，BvFT2的直系同源物FTL1的表达与短日照的花诱导相关，但与长日照加速开花无关［13］。在大麦（Hordeum vulgareL.）中，有12 个已知的FT类基因（HvFT），HvFT4在春季品种中的过表达延缓了长日照条件下的开花时间［14］。在菊花（Chrysanthemum morifoliumRamat）中，CsFTL3表达在短日照期间通过CsFTL3-CsFDL1复合物的反馈机制得到正调控，并且在反复短日照下，通过高水平CsFTL3诱导的反馈实现开花［15］。综上所述，在光周期途径中，FT同源基因在数量和结构等方面存在差异，导致FT同源基因可能存在相反或者冗余功能，从而呈现出早晚开花的差异，同时也表明FT在植物开花调控网络中扮演着至关重要的角色。根据定位结果，比较晚开花wym-97（var.communisTesn et Lee）和早开花cx-49（var.tsaitaiHort.）两个品种中的BcFT启动子发现，cx-49 的BcFT启动子存在1 577 bp 的插入片段，而且cx-49 的BcFT启动子活性高于wym-97，故推测cx-49 的BcFT启动子中的插入片段在不结球白菜开花中发挥重要作用［11］，但其调控机制仍不清楚。

酵母单杂交技术是用于研究DNA 与蛋白质相互作用的技术［16］，目前该技术已在多个物种中得到应用。例如，在玉米（Zea maysL.）中，ZmNF-YA3 蛋白与ZmCO-like 和ZmFPF1 相互作用形成复合物，然后与ZmFT-like12 的启动子区域结合来促进玉米早开花［17］；在蝴蝶兰（Phalaenopsis aphroditeRchd）中，酵母单杂交数据表明，PhSVP 蛋白与PhFT3基因的启动子相互作用，从而抑制PhFT3的表达，最终影响蝴蝶兰的开花时间［18］。由此可见，酵母单杂交是描述基因表达调控的有效方法之一。为了探究不结球白菜cx-49的BcFT启动子中的插入片段在不结球白菜开花中的调控机制，本研究通过克隆BcFT的启动子序列并利用酵母单杂交技术筛选BcFT上游转录调控因子，以期为进一步阐明不结球白菜成花的分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 供试材料为不结球白菜品种NHCC001 和cx-49，分别由南京农业大学白菜系统生物学实验室（本课题组）和浙江省农业科学院提供。将以上种子用去离子水清洗后，放置于培养皿中湿润滤纸上，室温催芽1～2 d 后移栽至穴盘中，置于人工气候室（16 h光照，22 ℃/ 8 h黑暗，18 ℃）中生长。待第二片真叶完全展开时取样，并将样品放置在液氮中速冻，保存于-80 ℃冰箱。

1.1.2 试验试剂 酵母单杂交中的诱饵载体pAbAi由本课题组提供。酵母Y1HGold 菌株由南京农业大学园艺学院白菜系统生物学实验室保存。大肠杆菌DH5α 感受态购自南京擎科生物科技有限公司。电转化大肠杆菌感受态细胞HST08、PrimeSTAR Max DNA聚合酶、TaKaRa MiniBEST 植物RNA 提取试剂盒（TaKaRa Code No.9769）、DNA 连接试剂盒（TaKaRa Code No.6022）、TaKaRa MiniBEST DNA 片段纯化试剂盒（TaKaRa Code No.9761）、SMART cDNA 文库构建试剂盒（Clontech Code No.634901）、Advantage 2 PCR 试剂盒（Clontech Code No.639206）、CHROMA SPIN-1000-TE 离心柱（Clontech Code No.636079）、TRIMMER DIRECT cDNA 均一化试剂盒（Evrogen Cat#NK003）、酵母空载质粒pGADT7，均购于宝生物工程（大连）有限公司。RNA 提取试剂盒和DNA 提取试剂盒均购于天根生化科技（北京）有限公司。Hifair Ⅱ1st Strand cDNA 反转录试剂盒（11119ES60）购于翌圣生物科技（上海）股份有限公司。各种工具酶购于南京有晴生物科技有限公司。引物合成及测序由南京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA 和基因组DNA 的提取及cDNA 的合成 使用RNA 提取试剂盒提取NHCC001 总RNA，用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA 提取结果，然后使用Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA 反转录试剂盒合成cDNA。使用DNA提取试剂盒提取cx-49总DNA。

1.2.2 酵母单杂交cDNA 文库的构建 取4 叶期NHCC001 叶片0.2 g 在液氮中充分研磨，用RNA 提取试剂盒进行NHCC001 总RNA 的提取，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测RNA提取结果。使用cDNA文库构建试剂盒及PCR 试剂盒合成cDNA，然后使用cDNA 均一化试剂盒对纯化后的cDNA 进行均一化处理，继而使用cDNA 均一化试剂盒及PCR 试剂盒对处理后cDNA 进行PCR 扩增。进一步使用限制性内切酶SfiI对扩增得到的cDNA 进行酶切处理，然后使用离心柱对酶切后cDNA 进行过柱净化，用ddH2O 溶出。取pGADT7-SfiI vector 与过柱后的cDNA，使用DNA 连接试剂盒在12 ℃条件下进行连接。对获得的连接液进行纯化精制，得到初级cDNA文库。

1.2.3 cDNA 文库的检测与鉴定 取少量初级文库连接液，电转化感受态细胞HST08；取适量转化液涂布Amp 抗性LB 平板，37 ℃过夜培养；通过平板上生长的菌落个数，计算初级文库库容。随机挑取96 个文库单克隆鉴定重组率，公式如下：

文库重组率=（PCR 扩增出的菌落数/进行PCR 的菌落数）×100%。

1.2.4 酵母感受态制备 挑取Y1HGold 菌株放入2 mL 酵母膏胨葡萄糖琼脂培养基（yeast extract peptone dextrose adenine medium，YPDA）液体培养基中，于30 ℃、250 r·min-1条件下过夜培养。取1.5 mL过夜培养的菌液加入到50 mL YPDA液体培养液中，30 ℃、250 r·min-1条件下振荡孵育2～3 h 至OD600达到0.4～0.6。将50 mL 菌液转移至离心管中，室温下700×g离心5 min。弃上清液，用30 mL 去离子水悬浮后700×g离心5 min，弃上清液，用1.5 mL TE/LiAc 重悬浮细胞，转到1.5 mL 离心管中。12 000 r·min-1离心15 s，弃上清液，用600 µL TE/LiAc 悬浮细胞，获得酵母Y1HGold感受态细胞。

1.2.5 构建pAbAi-proBcFT诱饵表达载体 对cx-49的BcFT启动子1 577 bp 序列进行克隆测序，使用在线软件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测启动子中的结合元件。将扩增片段重组到pAbAi 载体上，构成诱饵表达载体pAbAi-proBcFT。送南京擎科生物科技有限公司测序正确后，提取质粒并使用BbsI单酶切，随后转化至酵母感受态Y1HGold中。

1.2.6 诱饵载体转化及酵母菌株自激活检测 利用聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介导的醋酸锂感受态细胞转化法，将线性化的pAbAi-proBcFT转化到Y1HGold 酵母感受态细胞，并涂布于SD/-Ura 固体培养基上，于30 ℃培养2～3 d 后，挑取单菌落进行菌检。挑取正确的单菌落将OD600值调至0.23～0.28，吸取10 µL在SD/-Ura，SD/-Ura/AbA（金担子素，aureobasidin A 50 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（100 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（300 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（400 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（500 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（600 ng·mL-1），SD/-Ura/AbA（800 ng·mL-1）固体培养基上进行梯度验证。30 ℃培养3～4 d后，观察菌落数量及形态。

1.2.7BcFT上游调控基因的筛选 在600 µL感受态中加入变性的载体 DNA 20 µL，cDNA 文库10 µL，并与2.5 mL PEG/LiAc 混匀，30 ℃水浴45 min，然后加入160 µL 二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），轻轻颠倒混匀。随后将混匀液于42 ℃热激20 min。继而700×g离心5 min，去上清，加3 mL YPDA，30 ℃、250 r·min-1振荡培养1.5 h。再一次700×g离心5 min，去上清，加15 mL 生理盐水重悬。最后涂布于SD/-Ura/-Leu/AbA（800 ng·mL-1）的固体培养基上，30 ℃培养3～4 d。

1.2.8BcFT上游调控基因的获得 根据pGADT7 载体图谱设计引物（表1），对SD/-Ura/-Leu/AbA（800 ng·mL-1）固体培养基上生长的菌落进行PCR 检测。将PCR 产物送至南京擎科生物科技有限公司测序，然后在NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）上对测序结果进行比对。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the paper

1.2.9 酵母单杂交验证 将筛选得到的候选基因重组到pGADT7 载体，随后将构建好的载体转化到含有线性化pAbAi-proBcFT重组载体的Y1HGold 酵母感受态细胞中。最终将测序正确的菌液OD600调至0.2，并涂布于SD/-Ura/-Leu/AbA（800 ng·mL-1）固体培养基上30 ℃培养3～5 d。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取

提取不结球白菜NHCC001 的总RNA，经检测OD260/280=2.11，质量浓度为967 µg·µL-1，数据表明获得的总RNA 中未被DNA、蛋白质和其他小分子污染，可用于下一步试验。取300 ng 的RNA 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，总RNA 有18 S 和28 S 两条清晰的条带，说明提取的总RNA 质量合格，未发生降解，可以进行cDNA的合成（图1）。

图1 总RNA的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测Fig.1 Total RNA analysis on 1.5% agarose gel

2.2 cDNA文库的构建

以1 µg 的RNA 为模板，通过SMART 技术反转录合成cDNA，经离心柱纯化后，取1 µL cDNA 进行1.5%琼脂糖凝胶电泳用于检测cDNA 合成效果。试验结果显示，合成的双链cDNA 呈弥散状分布，片段长度分布范围约400～2 000 bp，大小主要分布在1 000 bp 左右（图2）。结果表明cDNA全长性较好，符合建库要求。

图2 双链cDNA的1.5%琼脂糖凝胶电泳检测Fig.2 Double-stranded cDNA analysis on 1.5% agarose gel

2.3 文库质量鉴定

本试验所得的cDNA 文库库容为1.8×106CFU，高于1.0×106CFU，能够保证筛选到低丰度的基因［19］。同时，1.5%琼脂糖凝胶电泳显示，初级文库的平均插入片段长度分布范围约400～2 000 bp，平均长度大于1 000 bp，重组率为100%。结果表明，本次构建的酵母文库提高了获得基因完整序列的可能性，且达到了高质量的标准，可用于酵母杂交分析（图3）。

2.4 BcFT启动子结合元件分析

使用引物proBcFT-F/R 扩增不结球白菜cx-49 的BcFT上游1 577 bp 启动子序列，使用在线软件PlantCARE分析BcFT启动子中的顺式作用元件，结果如表2所示。BcFT启动子中存在多种结合元件，主要包括光反应元件、脱落酸（abscisic acid，ABA）响应元件和胁迫响应元件。以上结果表明，BcFT上游调控因子可能通过参与光周期途径或胁迫响应途径调控不结球白菜开花。

表2 BcFT启动子顺式作用元件预测Table 2 Prediction of cis-acting elements in BcFT gene promoter

2.5 诱饵载体构建及自激活验证

构建酵母表达载体pAbAi-proBcFT并通过酶切将其线性化，然后转入酵母菌株Y1HGold。在SD/-Ura固体培养基中加入不同浓度的AbA，验证pAbAiproBcFT是否存在自激活性，结果表明pAbAi-proBcFT在800 ng·mL-1AbA 的SD/-Ura 中生长受到抑制（图4），故在此浓度下可以进行酵母文库筛选。

图4 pAbAi诱饵载体自激活检验Fig.4 Self-activation test of pAbAi bait vector

2.6 酵母单杂交筛选及阳性菌落PCR测序分析

将pAbAi-proBcFT作为诱饵进行酵母单杂交筛库。涂板5 d 后，在SD/-Leu/-Ura/AbA 800 ng·mL-1平板上共获得138个单菌落。对单菌落进行酵母PCR 测序后，进行BLAST序列同源比对，最后筛选到3个候选蛋白：BcSAP18、BcDEAR2和BcPUB14（图5）。

图5 候选基因单菌落PCRFig.5 PCR detection of insert fragments in the primary library

2.7 酵母单杂交验证

为了进一步验证BcSAP18、BcDEAR2 和BcPUB14对BcFT的调控作用，克隆BcSAP18、BcDEAR2和BcPUB14基因全长并连接到pGADT7，分别命名为pGADT7-BcSAP18、pGADT7-BcDEAR2和 pGADT7-BcPUB14。在已转入线性化pAbAi-proBcFT的酵母Y1HGold 中分别转入上述3 个重组质粒。分别涂布于AbA 浓度为800 ng·mL-1的SD/-Ura/-Leu 固体培养基上。pAbAi-proBcFT+pGADT7 作为阴性对照，pAbAiproBcFT+pGADT7-BcSAP18/BcDEAR2/BcPUB14为试验组。结果表明，BcSAP18 和BcDEAR2 与BcFT之间存在互作（图6）。

图6 酵母单杂验证Fig.6 Yeast-one-hybrid verification

3 讨论

FT 蛋白是从叶子运输到顶芽的移动信号，FT的转录受到上游促进和抑制因子的严格控制［20］。前人研究表明，不结球白菜FT基因在开花过程中起着关键作用，本试验根据前人研究获得的数量性状基因座（quantitative trait locus，QTL）定位结果［11］，对BcFT进行分析，成功克隆BcFT的1 577 bp 启动子序列。并使用在线软件PlantCARE 预测了BcFT启动子中存在脱落酸响应元件、胁迫响应元件和多个光响应元件，由此推测BcFT的上游调控因子可能参与了光反应途径或者胁迫响应途径。本试验使用SMART技术合成cDNA避免了克隆短cDNA 的偏差，使用该技术构建cDNA 文库富集了全长cDNA 并保留了更多的5’末端序列。同时，SMART 方法比其他技术需要更少的步骤、时间和起始RNA 量［19］，通过检测cDNA 文库库容、重组率和平均插入片段大小，证明了本试验构建的不结球白菜酵母杂交cDNA 文库样本信息的完整性良好，是一个高质量文库，可用于目的基因互作蛋白的筛选。本试验还克隆了BcFT的启动子序列并将其成功构建到诱饵表达载体pAbAi上，自激活试验结果表明，800 ng·mL-1AbA 可以抑制诱饵表达载体的自激活。酵母单杂交术基本原理是转录因子可以与靶基因启动子中的顺式作用元件相互作用，以调节靶基因的表达［21］。本试验利用上述构成的高质量cDNA 文库筛选与BcFT启动子互作的蛋白，最终初步筛选出BcSAP18 和BcDEAR2。

SIN3 ASSOCIATED POLYPEPTIDE 18（SAP18）是DNA 结合抑制剂的转录下调复合物的组成成分［22］，在拟南芥中参与植物胁迫条件下对激素敏感的转录调控［23］和植物开花时间调节［24］，推测BcSAP18可能参与不结球白菜开花时间调节。除了常见的6 条开花通路外，植物开花还会受低温［25］、干旱［26］等胁迫的诱导，而脱落酸在胁迫反应中起着核心作用［27］。本试验中，BcFT启动子中含有ABA响应元件和胁迫响应元件，由此推测SAP18可能参与脱落酸途径调节的不结球白菜开花。

DEAR2 编码ERF/AP2 转录因子家族的DREB 亚家族A-5 的成员。DEAR1在介导生物和非生物应激反应的信号通路之间的串扰方面具有上游调节作用［28］，但是前人对DEAR2探究较少。本试验初步验证了DEAR2 与BcFT启动子之间存在互作，但DEAR2在不结球白菜开花调控通路的具体作用还需更深层次的探究。

本研究为进一步阐释不结球白菜开花调控机制提供了新的思路和方向，但对BcSAP18和BcDEAR2调控BcFT的机制尚不清楚，还需通过双荧光素酶试验、电泳迁移率变动分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）等试验进一步验证。

4 结论

本研究以不结球白菜BcFT基因为研究对象，通过构建高质量的不结球白菜酵母杂交cDNA 文库，克隆菜心中BcFT基因的1 577 bp 启动子插入片段，并构建诱饵表达载体pABAi-proBcFT，利用酵母单杂交技术筛选BcFT基因上游调控因子，最终筛选到BcSAP18和BcDEAR2。