花期及提取方法对重瓣栀子花成分及活性影响

阙珊奇 杨良缘 胡 钰 张有做 许光治 王 艳 倪勤学

（浙江农林大学食品与健康学院，浙江 杭州 311300）

食用花卉是世界范围内丰富的自然资源［1］，随着人们对食用花卉的认识越来越科学和全面，食用花卉的营养价值和功效逐渐被认可，食用范围和品种也愈发广泛。研究发现，食用花卉中富含糖类、氨基酸、矿物质、多酚、黄酮、花青素等多种营养活性成分［2-3］，具有抗氧化［4］、抗炎［5］、抗癌、保护脏器、基因保护及神经保护等作用［6］。深入研究可食用花卉的营养价值、活性成分、功效作用等，有利于食用花卉在营养功能食品和天然抗氧化剂领域的开发利用［7］。

重瓣栀子花［Gardenia jasminoidesEllis var.fortuniana（Lindl.）Hara］又称白蟾、玉荷花等［8］，作为茜草科（Rubiaceae）栀子属（Gardenia）植物的花朵，其花朵大且为重瓣，多用于庭院观赏，主产于我国中部及中南部地区，在越南与日本也有种植。栀子花中含有糖类、维生素、微量元素、氨基酸等营养成分［9］及环烯醚萜类、酚类、黄酮类、有机酸酯类等活性物质［10-11］。陈犇等［12］发现栀子花酵素液中的总糖和总酸含量较高；Zhang 等［13］从野生栀子花中分离得到环烯醚萜类、酚类、黄酮类等21种化合物，其主要成分具有抗压降脂、抑菌抗炎的药理作用；徐晓俞等［14］发现栀子花细胞液含有较多的醇类、萜烯类、酮类、酚类等抗焦虑、抗菌、抗炎成分。目前，大量科学研究集中于栀子属植物的化学成分、药理活性、相关作用机制和安全性等方面，研究对象多为栀子果实，少有研究关注栀子花成分及功能活性，对栀子花的开发利用仍处于探索阶段。为进一步开发栀子花卉资源，本试验研究不同花期和不同提取方式对重瓣栀子花营养、活性成分含量及抗氧化活性等的影响，探究其最佳采摘期及提取方式，旨在为食用栀子花卉的栽培及开发提供参考，并为综合利用栀子花卉资源提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验材料 重瓣栀子花采摘于浙江农林大学平山试验基地，根据花瓣盛开情况分为3 类：花蕾期（微露外层白色花瓣）、盛开期（完全露出白色花瓣）、衰败期（露出褐色花瓣且萎蔫），如图1所示。新鲜重瓣栀子花采摘除杂后，于-80 ℃冷冻3 d 后进行冷冻干燥，制备成冻干花，粉碎备用。

图1 不同花期重瓣栀子花Fig 1 Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.）Hara at different florescence

1.1.2 试剂 芦丁、栀子苷、福林酚，上海源叶生物科技有限公司；2，4，6-三（2-吡啶基）-1，3，5-三嗪［2，4，6-tris（3-pyridyl）-1，3，5-triazine，TPTZ］，北京百灵威试剂有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-alpha-D-glucopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶，德国Sigma 公司；葡萄糖、没食子酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2＇-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸［2，2＇-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS］、阿波卡糖、考马斯亮蓝、牛血清蛋白，阿拉丁试剂（上海）有限公司；乙醇、石油醚、浓盐酸、浓硫酸（均为分析纯）、苯酚、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、硫酸亚铁、磷酸二氢钾、过硫酸钾、氯化铁、抗坏血酸，上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

DS-2510 DTH 超声波清洗器，上海生析超声仪器有限公司；YB-1000 A高速多功能粉碎机，金华永康速锋工贸有限公司；UV-5500紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；TGL-20B-C 高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；SHB-Ⅲ-A 循环水式多用真空泵，杭州大卫科教仪器有限公司；RE-52 A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；BSA 224 S 分析天平，上海人和科学仪器有限公司；DGG-9123 AD 电热恒温鼓风干燥箱，上海森信试验仪器有限公司；DK-S 24 电热恒温水浴锅，上海精宏试验设备有限公司；Freezone™ 18 L立式冻干机，美国Labconco公司。

1.3 试验方法

1.3.1 重瓣栀子花提取物的制备

1.3.1 .1 乙醇提取物的制备 取重瓣栀子干花10 g，以1∶20 的料液比加入200 mL 无水乙醇，30 ℃超声30 min后将料液进行抽滤，重复操作2次，合并滤液，旋蒸得到浸膏，-80 ℃冷冻3 d后进行冷冻干燥，称重备用。

1.3.1 .2 水浸提物的制备 取重瓣栀子干花10 g，以1∶20的料液比加入200 mL蒸馏水，30 ℃超声30 min后将料液进行抽滤，重复操作2 次，合并滤液，旋蒸得到浸膏，-80 ℃冷冻3 d后进行冷冻干燥，称重备用。

1.3.1 .3 石油醚提取物的制备 取重瓣栀子干花10 g，以1∶20的料液比加入200 mL石油醚，30 ℃超声30 min后将料液进行抽滤，重复操作2 次，合并滤液，旋蒸得到浸膏，-80 ℃冷冻3 d后进行冷冻干燥，称重备用。

1.3.1 .4 水蒸气蒸馏物的制备 取重瓣栀子花鲜花1 kg 于蒸馏锅中，以1∶6 的料液比加入6 000 mL 蒸馏水进行蒸馏，取蒸馏液静置分层，收集上层液，加无水硫酸钠脱水12 h后过滤，得到蒸馏产物，称重备用。

按照公式计算栀子花提取物得率：

1.3.2 水分含量测定 根据《GB 5009.3-2016 食品安全国家标准 食品中水分的测定》［15］，采用直接干燥法测定水分含量。

1.3.3 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，根据徐亚等［16］的方法并稍作调整。以牛血清蛋白为标准品绘制标准曲线，得到曲线方程为：Y=4.318 4X+0.001（R2=0.994 8，n=6），结果以每克干基中牛蛋白血清当量表示。

1.3.4 脂类含量测定 根据《GB 5009.6-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》［17］，采用索氏抽提法测定脂类含量。

1.3.5 总糖含量测定 采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，根据Rover等［18］的方法并略作调整。以葡萄糖为标准品绘制标准曲线，得到曲线方程为：Y=12.814 0X-0.014（R²=0.995 0，n=6），结果以每克干基中葡萄糖当量表示。

1.3.6 总酚含量测定 根据张露等［19］的方法，采用Folin-Ciocalteu 比色法测定总酚含量。以没食子酸为标准品绘制标准曲线，得到曲线方程为：Y=0.073 7X+0.004（R2=0.998 6，n=5），结果以每克干基中没食子酸当量表示。

1.3.7 总黄酮含量测定 采用硝酸铝-亚硝酸钠-氢氧化钠显色法测定总黄酮含量，根据孙晓波等［20］的方法并稍作调整。以芦丁为标准品绘制标准曲线，得到曲线方程为：Y=5.065 7X+0.003（R²=0.996 8，n=5），结果以每克干基中芦丁当量表示。

1.3.8 总环烯醚萜类含量测定 根据周婷婷等［21］的方法，以栀子苷为标准品绘制标准曲线，得曲线方程为：Y=0.028 1X-0.005 3（R²=0.998，n=7），结果以每克干基中栀子苷当量表示。

1.3.9 DPPH 自由基清除能力测定 根据Zhang等［22］的方法并稍作调整，以无水乙醇为空白对照，抗坏血酸（Vitamin C，Vc）为阳性对照。样品提取液对DPPH 自由基清除能力以清除率达到50%时所需要的样品质量浓度（IC50，µg·mL-1）表示。计算公式如下：

式中，A0为2 mL DPPH 溶液和2 mL 乙醇溶液的吸光度；A1为2 mL DPPH 溶液和2 mL 样品溶液的吸光度；A2为2 mL乙醇溶液和2 mL样品溶液的吸光度。

1.3.10 ABTS自由基清除能力测定 参考Taneva等［23］的方法并稍作调整，以无水乙醇为空白对照，抗坏血酸（Vc）为阳性对照，样品提取液对ABTS 自由基清除能力以IC50表示。计算公式如下：

式中，As为3.9 mL ABTS 工作液和0.1 mL 乙醇溶液的吸光度；An为3.9 mL ABTS 工作液和0.1 mL 样品溶液的吸光度；Am为3.9 mL 乙醇溶液和0.1 mL 样品溶液的吸光度。

1.3.11 总抗氧化能力FRAP 值测定 参考Dong等［24］的方法，得到标准曲线为Y=0.637 5X+0.034 4（R²=0.991 1，n=7）。取重瓣栀子花样品0.4 mL，铁离子还原抗氧化能力（ferricion reducing ability of plasma，FRAP）工作液3 mL，混匀后37 ℃水浴加热10 min，于593 nm处检测吸光度。

1.3.12 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定 根据Barik等［25］的方法并略作调整，用二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）将样品稀释成适宜浓度梯度，以阿卡波糖作为阳性对照，在405 nm处测定其吸光值，并计算IC50。α-葡萄糖苷酶抑制率计算公式如下：

式中，Aa为酶、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）工作液、底物的吸光度；Ab为PBS 工作液和底物的吸光度；Ac为酶、样品、底物、PBS 工作液的吸光度；Ad为PBS工作液、样品、底物的吸光度。

1.3.13 抑菌活性的测定

1.3.13 .1 菌种活化 配制牛肉膏蛋白胨液体培养基，分别将大肠杆菌、枯草芽孢杆菌加入到液体培养基中进行活化培养，放置于37 ℃的摇床中振荡培养24 h。配制马铃薯葡萄糖琼脂培养基，分别将酵母菌、根霉菌加入固体培养基中进行划线活化培养，放置于28 ℃的恒温培养箱中培养48 h。

1.3.13 .2 抑菌圈试验 采用牛津杯法［26］测定重瓣栀子花的抑菌能力。在营养琼脂平板上打入100 µL菌悬液，均匀涂布在培养基表面。培养基上呈“品”字型放置3 个灭菌后的干燥牛津杯（内径6 mm，外径8 mm）。吸取各样品溶液50 µL加入牛津杯中，将培养基置于恒温培养箱中培养（大肠杆菌与枯草芽孢杆菌于37 ℃下培养24 h，酵母菌与根霉菌于28 ℃下培养48 h）。以蒸馏水为阴性对照，平行3次试验，用游标卡尺测量抑菌圈直径。

1.4 数据处理

各处理3次重复，结果以Xˉ± S表示，用SPSS 22及Excel 2010 进行数据统计分析，用Origin 2021 软件绘图，Adobe Photoshop 2020 进行图片处理。

2 结果与分析

2.1 不同花期重瓣栀子花的营养成分分析

由表1 可知，盛开期和衰败期重瓣栀子花的含水率有显著差异，盛开期比衰败期高1.81%；脂类和蛋白质含量的范围分别为1.15%～1.37%和0.61%～0.67%，不同花期间无显著差异。花蕾期和盛开期重瓣栀子花的糖类含量均显著高于衰败期，分别是衰败期的1.26和1.22倍。表明重瓣栀子花在生长过程中4种营养成分的含量会有一定的变化，但总体变化较小，其中盛开期的重瓣栀子花营养品质较好。

表1 不同花期重瓣栀子花的营养成分含量Table 1 Nutrient content of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara at different florescence/%

2.2 不同花期重瓣栀子花的活性成分分析

酚类、黄酮类、环烯醚萜类是栀子花中重要的活性物质，不同花期的重瓣栀子花中3 种生物活性成分的含量见图2。结果表明，3 个花期的重瓣栀子花中总酚、总黄酮及总环烯醚萜含量均具有显著差异，总酚、总黄酮和总环烯醚萜含量分别为0.77%～1.58%、0.68%～4.36%和8.85%～10.91%。其中，盛开期重瓣栀子花的总酚、总黄酮和总环烯醚萜含量分别达到1.58%、4.36%和10.91%，均显著高于花蕾期和衰败期。表明重瓣栀子花在生长过程中活性成分的含量变化较大，其中盛开期的重瓣栀子花活性成分含量较高。

图2 不同花期重瓣栀子花活性成分含量Fig.2 Active ingredient content of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara at different florescence

2.3 不同花期重瓣栀子花的抗氧化活性分析

重瓣栀子花中抗氧化物质对自由基的清除能力以及对金属离子的还原能力是检测其体外抗氧化活性的有效方法。DPPH 自由基清除率达到50%时所需的样品质量浓度越低，则清除效果越好。由表2可知，盛开期重瓣栀子花DPPH IC50为110.83 µg·mL-1，清除能力显著高于花蕾期和衰败期。同时，3 个花期重瓣栀子花的ABTS 自由基清除能力有显著差异，清除能力表现为盛开期＞花蕾期＞衰败期。盛开期的FRAP 值为0.710 mmol·g-1，略高于花蕾期和衰败期，无显著差异。表明不同花期重瓣栀子花均具有抗氧化活性，盛开期重瓣栀子花DPPH、ABTS自由基清除能力、FRAP铁离子还原能力均大于花蕾期和衰败期，有一定的抗氧化活性。

表2 不同花期重瓣栀子花的抗氧化能力Table 2 Antioxidant capacity of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara at different florescence

2.4 不同提取方法对重瓣栀子花的活性成分影响

不同花期重瓣栀子花的营养成分、活性成分及抗氧化活性测定结果显示，盛开期重瓣栀子花的品质较好，因此选择盛开期的重瓣栀子花为材料，通过不同的提取方法得到重瓣栀子花提取物，并测定其活性成分，结果如图3所示。不同提取方法的重瓣栀子花提取得率有显著差异，乙醇提取物和水提取物的得率分别为30.53%和45.73%，分别是石油醚提取物的13.45 和20.14 倍，而水蒸气蒸馏物的得率极低，仅为0.03%。

图3 不同提取方法对重瓣栀子花得率及活性成分含量影响Fig.3 Effects of the yield and content of active components of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara by different extraction methods

在总糖含量上，乙醇提取物和水提取物显著高于石油醚提取物和水蒸气蒸馏物，分别达到44.04%和53.53%，是石油醚提取物的6.23和7.81倍，水蒸气蒸馏物的7.88 和9.58 倍。各提取物之间的总酚含量也存在显著差异，乙醇提取物的总酚含量是水提取物的2.77 倍、石油醚提取物的2.47 倍、水蒸气蒸馏物的4.13 倍。总黄酮含量同样表现为乙醇提取物＞石油醚提取物＞水提取物＞水蒸气蒸馏物，各提取物之间含量差异显著，其中乙醇提取物的总黄酮含量最高，为8.40%。在不同提取方法中，除了石油醚提取物中未能检测到总环醚萜类物质外，其余各提取物之间差异显著，乙醇提取物总环烯醚萜含量最高，为19.80%。上述结果表明，乙醇和水作为提取溶剂，提取物的得率和总糖含量较高，且乙醇提取物中总酚、总黄酮、总环烯醚萜含量显著高于其他3 种溶剂，更有利于保留重瓣栀子花的活性成分。

2.5 不同提取方法对重瓣栀子花抗氧化能力及α-葡萄糖苷酶抑制活性影响

由表3 可知，不同提取方法得到的重瓣栀子花提取物对DPPH 自由基都有一定的清除能力。其中乙醇提取物的清除能力显著高于其他提取物，IC50值为98.50 µg·mL-1。重瓣栀子花乙醇提取物和水提取物的ABTS 自由基清除能力较强，显著高于其他提取物，IC50值分别为65.79 和76.16 µg·mL-1。FRAP 铁离子还原能力表现为水蒸气提取物＞乙醇提取物＞石油醚提取物＞水提取物，可见水蒸气蒸馏物和乙醇提取物有较好的铁离子还原能力。重瓣栀子花乙醇提取物的α-葡萄糖苷酶IC50值为275.48 µg·mL-1，而石油醚提取物、水提取物和水蒸气蒸馏物未表现出α-葡萄糖苷酶抑制活性。

表3 不同提取物方法对重瓣栀子花的抗氧化活性及α-葡萄糖苷酶抑制活性影响Table 3 Effect of different extract methods on antioxidant activity and α- glucosidase inhibitory activity of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara

综上，相较于其他提取物，重瓣栀子花乙醇提取物具有更全面且良好的抗氧化能力及对α-葡萄糖苷酶的抑制活性，水提取物具有较好的DPPH、ABTS 自由基清除能力，而水蒸气蒸馏物具有较好的铁离子还原能力。

2.6 不同提取方法对重瓣栀子花抑菌能力的影响

根据抗微生物药物敏感性的判定标准，抑菌圈直径大于20 mm 为极敏感，15～20 mm 为高度敏感，10～15 mm为中度敏感，小于10 mm为低度敏感［27］。通过对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌及真菌的抑菌试验，检测重瓣栀子花不同提取方法的抑菌效果。由表4可知，重瓣栀子花不同提取方法对不同菌种的抑菌效果存在差异，其中大肠杆菌对重瓣栀子花水蒸气蒸馏物（11.37 mm）和石油醚提取物（10.23 mm）中度敏感，枯草芽孢杆菌对水提取物（10.18 mm）、石油醚提取物（10.47 mm）和水蒸气蒸馏物（10.33 mm）中度敏感；四种提取物均未表现出对根霉菌的抑制作用。抑菌圈的直径可以直接表现出试验组分的抑菌能力，直径越大，抑菌效果越强。由此可知，在同等浓度条件下，重瓣栀子花水蒸气蒸馏物的抑菌效果较强，其对大肠杆菌的抑制作用最明显。

表4 不同提取方法对重瓣栀子花抑菌圈的影响Table 4 Effect of the bacteriostatic circle of Gardenia jasminoides Ellis var. fortuniana （Lindl.） Hara with different extraction methods/mm

3 讨论

目前，栀子果不同提取方法的制备工艺及其活性研究相对成熟［28-29］，而有关栀子花提取物制备［30］及活性影响［31］的研究较少，特别是针对栀子花中营养成分的研究更鲜见报道。本研究利用重瓣栀子花测定不同生长期糖类、蛋白质、脂类、水分含量及其变化，可为栀子花在营养食品方面的开发利用提供参考。

黄酮类物质可有效清除自由基，减弱自由基对机体的损害［32］。多酚通过螯合金属离子或作为供氢的自由基清除剂抑制氧化活性，同时对提高DPPH、ABTS自由基清除率具有协同作用［33］。本研究中，盛开期重瓣栀子花相较于花蕾期和衰败期的DPPH、ABTS 自由基清除能力更强，其总酚、总黄酮含量也显著高于花蕾期和衰败期，由此推测重瓣栀子花中总酚和总黄酮是影响其抗氧化能力的重要因素。这与Pang 等［34］和Reddy 等［35］的结论一致，即酚类、黄酮类化合物含量与抗氧化潜能之间存在很强的正相关关系。为进一步验证此结论，后续可对栀子花中黄酮类、酚类物质进行分离鉴定，并对其生理活性开展研究。

α-葡萄糖苷酶抑制剂可有效控制α-葡萄糖苷酶活性，是降低II 型糖尿病及并发症发生率的有效方法［36］。目前II 型糖尿病的治疗中最常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂药物存在较大毒副作用［37］，因此从植物天然产物中寻找安全低毒的治疗药物具有巨大的前景［38］。杨前东［39］发现提取的栀子花化合物具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，认为栀子花中乙酸、甲酸和黄酮类可能是发挥降糖作用的主要成分。本研究中，重瓣栀子花乙醇提取物对α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用，IC50值为275.48 µg·mL-1；且仅在乙醇提取物中检测到抑制作用，这可能与其含有较多酚类、黄酮类极性较小的活性成分有关［40-41］。后续应深入开展栀子花提取物化学成分研究，并进行体内药效学验证，以期从中发现高效、新型的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

通过水蒸气蒸馏或溶剂萃取等方法从植物体内获得的挥发性物质具有抗菌作用［42］。本研究发现，重瓣栀子花提取物对细菌的抑制能力强于对真菌的抑制能力，其中重瓣栀子花水蒸气蒸馏物对微生物的敏感度更高，对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌的抑制效果较好。水蒸气蒸馏物中富含挥发性物质，这可能是其相较于其他提取物抑菌效果更好的原因。后续需进一步研究重瓣栀子花不同提取物中的具体成分以及不同浓度的提取物对微生物抑制能力的影响。

4 结论

本研究发现花期和提取方法对重瓣栀子花的成分和活性均有影响。其中盛开期重瓣栀子花活性成分及抗氧化活性最好；重瓣栀子花乙醇提取物的活性成分含量、自由基清除能力以及抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力均显著优于其他提取物；水蒸气蒸馏物的抑菌效果最佳，对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌较敏感。