杠板归总黄酮提取物对肝硬化腹腔积液大鼠肝功能及水通道蛋白的影响

佘朋桂,谭小雯,郭红玲

失代偿期肝硬化是进行肝脏移植术的常见病因,而腹腔积液是腹部游离液体的蓄积在腹膜腔内,是肝脏失代偿的一个典型特征,约20%的肝硬化患者伴有腹腔积液,每年1%～4%的肝硬化患者出现腹腔积液[1]。腹腔积液可导致预后不良及高病死率[2],因此,肝硬化腹腔积液的预防与治疗是临床诊疗的重难点。中医学认为,肝硬化腹腔积液属于“臌胀”范畴,以腹部胀大、脉络暴露、皮肤苍黄为主要特征,是“风劳臌膈”四类疑难杂症之一[3-4]。有研究表明,杠板归具有缓解肝病病理症状的功效,其提取物杠板归总黄酮(TFP)可通过抑制炎症应激和细胞凋亡,以改善肝脏损伤[5]。水通道蛋白(AQPs)是近年临床研究的新热点,其是主要分布在肝脏内调节细胞内外水渗透性及转运的重要蛋白,与细胞水液代谢密切相关。因此,本研究制备了肝硬化腹腔积液大鼠模型,以探讨TFP对肝硬化腹腔积液大鼠肝功能及AQPs的影响,以期为临床治疗提供实验依据,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源 于2021年12月选取60只SD大鼠(购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,43004700038932),周龄6～8周,体质量(220±20)g。随机选取10只作为空白对照组,另50只采用以四氯化碳—乙醇综合法制备肝硬化腹腔积液大鼠模型,并随机将建模大鼠分为模型对照组、阳性对照组及TFP高、中、低剂量组,各10只。

1.2 实验药品、试剂及仪器 杠板归(饮片,湖南三湘中药饮片有限公司生产),TFP制备方法参照文献[6];四氯化碳(南京化学试剂股份有限公司生产),白酒(乙醇体积分数为50%,山西德道酒业有限责任公司生产),橄榄油(山东玉膳房食品有限公司生产),甘草酸二铵胶囊(正大天晴集团生产),一抗、二抗(上海泽叶生物科技有限公司生产),全自动生化分析仪(深圳市蓝韵实业有限公司),多功能彩色细胞图像分析管理系统(美国Media Cybernetics生产)。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备:将大鼠放在饲养箱内,每个饲养箱3只,饲养温度为22～24 ℃,相对湿度为40%～60%,每日明暗交替各12 h,常规饮用水及饲料喂养。适应性喂养1周,随机选取10只作为空白对照组,标准饮食喂养24周,处死,留取标本。

剩余50只大鼠采用四氯化碳—乙醇法进行肝硬化腹腔积液模型构建:采用40%的四氯化碳—橄榄油溶液灌胃,每次灌胃前测量体质量,每4 d一次,首次剂量为0.5 ml/100 g,第2次开始将灌胃液剂量改为0.3 ml/100 g,并以15%乙醇作为大鼠饮料,饲料喂养同空白对照组,连续喂养10周。若大鼠腹部明显膨隆、皮下有波动感,经腹腔穿刺后发现有清亮但略显黄色液体流出,经检测白蛋白(Alb)<34.1 g/L,大鼠血浆胶体渗透压<17.4 mmHg,即可判断为造模成功[7]。

1.3.2 治疗方法:确定大鼠造模成功后,针对模型对照组大鼠予以0.9%氯化钠溶液进行灌胃;阳性对照组以0.9%氯化钠溶液溶解的甘草酸二铵胶囊(含甘草酸二铵0.005 2 g/kg)进行灌胃,1次/d,共14周;TFP低、中、高剂量组大鼠分别予以150、300、600 mg/kg的TFP进行灌胃,1次/d,共14周。治疗期间,阳性对照组与TFP低、中、高剂量组大鼠仍以0.3 ml/100 g的40%四氯化碳—橄榄油溶液灌胃至14周实验结束,处死,留取标本。

1.4 观察指标与方法 (1)腹腔积液量:处死大鼠后,沿腹中线剪开约为3 cm的创口,用无菌注射器抽取大鼠腹腔液体,记录并比较各组大鼠腹腔积液量。(2)实验室相关指标:各组大鼠均禁食12 h以上,称重,麻醉下腹主动脉取血5 ml至试管中,3 200 r/min离心10 min,取上层血清,置于-40 ℃冷冻箱内保存待测;采用全自动生化仪检测肝功能指标,主要包括天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和Alb水平;采用放射免疫发测定肝纤维化指标,主要包括Ⅳ型胶原(Ⅳ-C)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层粘连蛋白(LN)、透明质酸酶(HA)水平。(3)水通道蛋白8(AQP8)水平:处死大鼠,取肝脏组织,取一部分肝脏组织采用免疫组化法[8]检测肝AQP8,采用细胞图像分析管理系统分析细胞照片,检测阳性反应为积分光密度(IOD)值。(4)肝组织变化情况:处死大鼠,取肝脏组织,观察肝脏形态特征,取一部分肝脏组织进行HE染色切片,观察各组大鼠肝组织变化情况。

2 结 果

2.1 腹腔积液量及AQP8 IOD值比较 与空白对照组相比,模型对照组、阳性对照组及TFP低、中、高剂量组腹腔积液量较多,AQP8 IOD值较低(P<0.01);与模型对照组相比,阳性对照组及TFP低、中、高剂量组腹腔积液量较少,阳性对照组、TFP高剂量组AQP8 IOD值较高(P<0.01);与阳性对照组相比,TFP高剂量组腹腔积液量较多,AQP8 IOD值较低(P<0.01),见表1。

表1 6组大鼠腹腔积液量及AQP8 IOD值比较

2.2 肝功能指标比较 与空白对照组相比,模型对照组、阳性对照组及TFP低、中、高剂量组AST、ALT水平较高,Alb水平较低(P<0.01);与模型对照组相比,阳性对照组、TFP高剂量组AST与ALT水平较低,Alb水平较高(P<0.01);与阳性对照组相比,TFP高剂量组AST和ALT水平较高,Alb水平较低(P<0.01),见表2。

表2 6组大鼠肝功能指标比较

2.3 肝纤维指标比较 与空白对照组相比,模型对照组、阳性对照组及TFP低、中、高剂量组Ⅳ-C、PCⅢ、LN、HA水平均较高(P<0.01);与模型对照组比较,阳性对照组、TFP高剂量组上述指标均较低(P<0.01);与TFP高剂量组相比,阳性对照组上述指标均较低(P<0.01),见表3。

表3 6组大鼠肝纤维指标比较

2.4 大鼠肝组织病理学 光镜下观察各组大鼠组织病理学结果显示:空白对照组大鼠可见肝小叶结构清晰、细胞形态正常、静脉围绕中央呈放射状排列整齐,无炎症、变性或坏死等病理变化;模型对照组大鼠可见肝小叶明显破坏,出现变性、出血、炎症等病理改变,形成典型的假小叶;TFP低剂量大鼠可见肝小叶结构破坏,明显形成了假小叶,有大量炎性细胞浸润,出现变性、出血等病理改变;TFP中剂量组大鼠可见肝细胞纤维间隔形成有所减少,假小叶少量形成,炎性细胞浸润、变性现象基本消失;TFP高剂量组大鼠可见肝纤维组织增生但未见假小叶,肝小叶结构存在轻度破坏,肝细胞轻微肿胀及炎性细胞减少;阳性对照组大鼠可见纤维组织增生但未见假小叶,肝小叶结构破坏更轻,炎性细胞浸润及肿胀更轻微。

3 讨 论

肝硬化腹腔积液是由于肝细胞变性、坏死、再生,促使纤维组织增生和瘢痕收缩,使肝脏质地变硬,形成肝硬化,引起门静脉高压,肝功能损伤,进而导致腹腔积液形成。腹腔积液是肝硬化较常见的并发症之一,提示肝硬化的程度比较严重,并可能造成其他并发症与急性症状的发生,甚至死亡[9]。研究表明,肝硬化代偿期患者10年内并发腹腔积液的概率为50%,合并腹腔积液患者的病死率明显增高,其中肝硬化腹腔积液患者1年内病死率为15%、2年内病死率为44%[10]。目前,临床对于肝硬化腹腔积液的治疗,西医以利尿为主,并根据患者的实际病情酌情补充Alb、血浆等,必要时行穿刺放液或腹腔积液超滤浓缩回输治疗。然而当肝硬化患者腹腔积液反复发作,长期使用利尿剂较易产生耐药性,形成顽固性腹腔积液,因此寻求更加有效的治疗方法成为临床治疗腹腔积液的迫切需求。

中医药是中华民族的瑰宝,根据诊断对症下药可起到标本兼治的效果,且合理的药物治疗,其不良反应较少。在中医理论中,肝硬化腹腔积液的成因复杂,主要因患者嗜酒、食肥甘厚味、怒郁伤肝、虫毒伤及肝脾、日久痞块积聚或黄疸等可致脾失水运、三焦不畅,导致水停腹中[11]。中医对人体内水运及代谢早已有描述,认为肺、脾、肾等脏腑与水运及代谢关系密切,其中肺为华盖、为水之上源,通过肺的宣发肃降可通调水道[12]。杠板归性寒,味酸,归肺经与膀胱经,具有消肿利尿、清热解毒等多重功效,可用于治疗水肿、痢疾、湿热黄疸等,是一种具有多重病理作用及较高临床价值的传统中草药材[13]。黄酮类化学物为杠板归的主要活性成分,具有降低炎性、抗肝纤维化、抗氧化应激反应及细胞凋亡以改善肝损伤的作用[14-15]。基于此,本研究建立肝硬化腹腔积液大鼠模型,以探讨杠板归总黄酮提取物对肝硬化腹腔积液大鼠肝功能及AQPs的影响。

AQPs参与液体运输、细胞信号和生殖[16],AQP8在肝脏AQPs中呈高表达,可促进氨的摄取及代谢,AQP8水平异常,可减少毛细血管质膜的水液转运,导致肝细胞膜通透性降低[17-18]。AQP8水平下调,会导致肝细胞的转运能力减低,引起腹腔积液,而TFP能有效改善肝硬化腹腔积液大鼠肝组织细胞AQP8水平。本研究结果显示,与空白对照组相比,模型对照组、阳性对照组及TFP低、中、高剂量组腹腔积液量较高,AQP8 IOD值较低,且AST、ALT及Ⅳ-C、PCⅢ、LN、HA水平均较高,Alb水平较低,表明建模成功。此外,与模型对照组相比,阳性对照组及TFP低、中、高剂量组腹腔积液量较少,阳性对照组、TFP高剂量组AQP8 IOD值较高,可见TFP能有效改善肝硬化腹腔积液大鼠的腹腔积液症状及肝功能,上调AQP8水平。虽甘草酸二铵与高剂量TFP的疗效有差异。可通过合理的中药配伍组方遣药,进行下一步研究验证。

综上所述,TFP可有效改善肝硬化腹腔积液大鼠的肝功能,减少腹腔积液,上调AQP8的表达水平,这可能是TFP利水的作用机制,但甘草酸二铵与高剂量TFP的疗效差异仍需进一步研究证实。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。