22份中国高粱主产区品种重要农艺性状控制基因利用分析

朱振兴，李丹，张丽霞，李金红，陆晓春

（辽宁省作物分子改良重点实验室，辽宁省农业科学院 高粱研究所，辽宁 沈阳，110161）

高粱（Sorghum bicolor（L.） Moench）是全球五大作物之一，广泛种植于世界100多个国家及地区，至今仍然是全球5亿多人的口粮［1］。高粱用途广泛，可以食用、饲用和酿造等，在我国人民饮食结构调整、扶贫等农业生产活动中占有重要的地位。高粱具有耐干旱、耐涝、耐瘠薄、抗逆性强等特点，在我国北方旱作农业中占有重要地位［2］。随着基因组学、生物信息学、现代分子生物学、测序技术等学科的迅猛发展，作物分子育种水平逐步提升，育种选择的精确性也逐步提高。分子育种核心是重要农艺性状控制基因的利用［3］，摸清高粱主产区推广品种中重要农艺性状控制基因利用现状，对未来精准育种有重要指导意义。

目前，在高粱上已克隆的重要农艺性状控制基因大概有30多个，包括一些通过人工诱变突变体途径克隆的基因。然而在育种中来源于人工诱变突变体克隆的基因几乎很少能被利用，因此本文着重关注那些在自然群体中存在变异，有不同功能的等位基因，而且是调控高粱重要农艺性状的关键基因。符合这样特性的基因可以作为分子育种的背景基因筛选。在育种中一般比较关注的重要农艺性状有生育期、株高、糯性、单宁含量等。生育期与品种的适种地区、适合范围有极大的相关性，也是品种广适性最重要的限制因子。在高粱生育期调控上，报道有关的位点有Ma1、Ma2、Ma3、Ma4、Ma5以及Ma6［4］，而这 6个生育期调控的位点中，已经有 4 个基因被克隆，分别是Ma1［5］、Ma2［6］、Ma3［7］及Ma6［8］。其中Ma1基因编 码 一 个 Pseudo⁃response regulator protein 37（PRR37）；Ma2编码一个 SET-MYND结构域的赖氨酸甲基转移酶；Ma3是一个光敏色素B基因；Ma6编码一个Ghd7蛋白，能够在长日照下抑制开花。矮化株高被认为是适宜机械化收割品种中最重要的育种目标之一。高粱株高一般认为受4个位点调控Dw1、Dw2、Dw3、Dw4［9］，其中前 3 个基因已经被克隆，仅有DW4至今还未确定。DW3是最早被克隆的一个基因，通过玉米中的同源基因克隆将DW3鉴定为一个生长素转运蛋白，参与了生长素的极性运输［10］；DW1编码一个膜蛋白［11］；DW2则是一个蛋白激酶［12］，都参与调控节间的伸长。白酒产业在中国是很大一个产业，有着广泛的市场。其中糯高粱是中国白酒酿酒最重要的原料，高端白酒如茅台采用地方糯高粱品种“红缨子”为原材料。而高粱籽粒糯性方面，主要分为糯与非糯高粱，即支链淀粉与直链淀粉比例决定了高粱的糯与非糯。在糯性的控制上，至今报道糯性控制基因只有一个Wx，该基因编码一个颗粒结合淀粉合成酶。该基因功能在物种中非常保守，从水稻到玉米糯性都受此基因调控［13-14］。高粱Wx已经报道的等位变异类型包括4种类型Wx⁃a、Wx⁃b、Wx⁃c以及Wx⁃d［15］。单宁含量也是酿酒和食用高粱的重要指标，酿酒高粱的单宁含量一般要求含量在1%以上，而食用高粱一般要求单宁含量低。单宁含量重要调控基因Tannin1（Tan1）已经被克隆，该基因编码了1个WD40蛋白，控制了高粱中单宁生物合成［16］。该基因主要存在3种等位变异包括tan1⁃a、tan1⁃b和tan1⁃c，这些变异造成Tan1蛋白功能丧失，继而阻碍了籽粒中单宁的生物合成。高粱籽粒相对其它作物不容易消化，因而，提高高粱的消化性有重要意义。高粱中SbPUL基因编码一个支链淀粉酶，其不同等位基因决定了籽粒是否容易消化［17］，该基因有2种单倍型GD和RA型，其中携带RA型支链淀粉酶的品种籽粒的动物消化率更高。在高粱非生物胁迫上，中国南方很多地区是酸性土壤，该土壤中的铝毒害是限制高粱生产重要危害之一。SbMATE基因编码了一个根部柠檬酸外排转运蛋白，在高粱耐铝毒害上发挥重要作用［18］。

目前中国高粱种植主要集中在内蒙古、贵州、辽宁、吉林、四川、山西、黑龙江等地［2］。本研究搜集了22份这些主产地区3年（2018-2021年）部分推广高粱品种，通过分析生育期、株高等已经克隆重要性状控制基因在这些代表性品种中的携带状况，明确中国高粱育种中已经广泛利用基因以及潜力利用的基因，为高粱优异种质资源创制提供可行的理论基础和参考指南。

1 材料和方法

1.1 试验材料

高粱产业技术体系岗位推荐的不同主产区2018-2021年部分高粱推广品种22份，包括内蒙古自治区 6份：赤杂113、赤杂109、赤杂131、通杂108、通杂127、通杂136；吉林省5份：吉杂210、吉杂224、吉杂127、吉杂229、吉杂124；辽宁省3份：辽粘3、辽糯10、沈杂5号；黑龙江省2份：龙米粱1号和龙杂17；山西省3份：晋糯3号、晋杂22号、晋早5564；河北省1份：冀酿2号；四川省1份：青壳洋；贵州省1份：红缨子。

1.2 基因组DNA提取、PCR扩增及电泳分析

挑选饱满、色泽鲜亮的种子每份约60粒保证成苗30株，5%次氯酸钠溶液消毒10 min，灭菌蒸馏水清洗5~6遍，然后放入已垫入吸水纸的塑料组培小罐中37 ℃过夜催芽，最后放置于日光温室（30 ℃，12 h/22 ℃，12 h）中长苗 5~7 d。30株高粱嫩苗等量混合，DNA提取采用天根生化科技有限公司生产的高效植物基因组DNA提取试剂盒（DP350）。扩增引物利用Oligo7软件进行设计，在南京金斯瑞生物科技有限公司合成ePAGE级别引物，需要序列测定的PCR扩增产物送往江苏金唯智生物科技有限公司进行序列分析。PCR反应体系为20 µL，DNA模板的量为20~100 ng，PCR反应采用2×Fast Taq PCR Master mix（武汉赛维尔生物科技有限公司）反应试剂。PCR条件一般为95 ℃，2 min；98 ℃，10 s；58 ℃，30 s；72 ℃，Xs（1 kb·min-1）；36 个循环；72 ℃，5 min。其中Dw3基因扩增采用KOD⁃FX NeoTaq酶及其配套的2×buffer反应工作液以及dNTP（2 mmo·lL-1）（Toyobo 东洋纺（上海）生物科技有限公司）；PCR扩增采用两步法，95 ℃，2 min；98 ℃，10 s；68 ℃，1 min 30 s；36 个循环。1.5%琼脂糖或7%聚丙烯酰胺凝胶（武汉赛维尔生物科技有限公司）电泳检测PCR产物。

2 结果与分析

2.1 高粱已克隆重要性状控制基因不同等位基因相关信息

根据已克隆重要农艺性状控制基因的参考文献，对株高、生育期、单宁、糯性、籽粒易消化、耐受铝毒等基因相关信息进行总结和梳理，包括基因登录号、功能差异位点类型等信息（表1）。

2.2 不同等位基因检测引物设计

针对表1中涉及的基因及其不同突变类型，设计相应的检测引物，如表2所示。依据不同基因的突变情况，采用琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测以及PCR产物测序等方法进行基因分析。

表1 挑选的已克隆高粱重要农艺性状基因及突变情况汇总Table 1 Summary of selected cloned important agronomic trait genes and mutations in sorghum

表2 基因检测引物设计及检测方法Table 2 Primer design and detection methods for gene testing

2.3 重要农艺性状控制基因分析

对22份各主产区部分推广高粱品种的重要性状农艺性状控制基因功能位点分析结果如表3所示。在糯与非糯上，我们选取的糯高粱品种中都携带了Wx不同的突变类型，如酿酒糯高粱冀酿2号、晋糯3号以及辽粘3等品种携带wxa等位基因，西南地方酿酒优质高粱青壳洋和红缨子利用的是wxc等位基因。另外，黑龙江省农业科学院作物育种研究所育成的食用糯高粱龙米粱1号品种利用的是wxb基因型，其它高粱杂交种均不携带Wx不同突变类型。对现有的4个已经克隆的开花期Ma基因进行检测，结果发现，所有参试品种都不携带Ma2和Ma3突变基因型，表明目前品种育种中未用到这2个基因型的相关材料，而利用较多的是Ma1以及Ma6的突变型。早熟品种龙杂17携带杂合型Ma1/ma1和纯合ma6，而较早熟的赤杂109携带纯合ma1和ma6；相对晚熟品种晋杂22携带纯合ma1以及杂合型Ma6/ma6、青壳洋和红缨子仅携带突变型ma6，表明ma1和ma6基因功效具有叠加效应。值得注意的是，一些中晚熟品种如冀酿2号和沈杂5也携带纯合突变型ma1及ma6；另外有的材料利用的是杂合型的Ma1以及Ma6，如通杂127、吉杂127、晋早5564以及赤杂113，说明这2个基因可能具有杂合效应，或是还有其它未克隆的熟期控制基因起重要作用。在株高方面，纯合dw2和dw3利用较为广泛，杂合DW1/dw1利用相对较多，仅龙杂17携带纯合dw1。龙杂17属于早熟矮杆品种，在这些品种中株高最矮，不仅携带纯合dw1还携带纯合dw2；其它一部分高粱材料具有Dw1/dw1杂合基因型。重要酿酒高粱品种青壳洋的株高在这些品种中相对最高大概2.6 m，现有3个已克隆株高DW基因在青壳洋中都为野生型。而红缨子品种株高大概2.4 m，仅携带dw2，而其它2个DW基因是野生型。比较有意思的是尽管龙米粱1号、赤杂113以及赤杂109这3个品种株高并不是很高，但都携带野生型DW2、DW3以及DW1/dw1杂合型。在单宁的含量控制基因方面，主要检测了单宁重要调控基因Tan1的不同等位基因。

表3 22份高粱主产区主栽品种相关基因携带情况Table 3 Carrying situation of related genotypes of 22 selected varieties in sorghum producing areas

本文检测的品种中野生型居多，少部分为杂合型。单宁含量极低的食用高粱龙米粱1号携带tan1⁃b基因型。食用高粱品种沈杂5尽管单宁含量很低，仅携带tan1⁃b的杂合基因型，表明单宁含量的调控很可能存在其它基因。在耐铝毒基因资源利用方面，对SbMate基因检测的22份品种，均不携带抗铝毒相关基因。在籽粒易消化上检测的支链淀粉酶SbPUL基因，该基因有2种单倍型GD和RA型，其中携带有RA型支链淀粉酶的品种，籽粒动物消化率更高。作者发现仅在龙杂17品种中携带有纯合RA型支链淀粉酶基因，通杂136以及赤杂109携带了杂合型的GD/RA，其它品种均是GD型。

3 讨论

高粱是中国重要的杂粮作物，在白酒生产、扶贫以及边际土地利用上发挥重要作用［19］。分子育种代表了育种最前沿的方向，其核心是重要农艺性状控制基因的利用［3］。摸清现有育成品种中重要农艺性状控制基因利用现状，对指导育种方向有重要参考意义。本文通过搜集高粱主产地区部分推广高粱栽培种，通过检测生育期、株高等已经克隆重要农艺性状控制基因的基因型，分析这些关键基因的利用情况，为将来高粱分子育种基因及材料的选择提供参考依据。

从糯与非糯调控基因Wx来看，高粱中Wx基因也是调控糯性最重要的基因，与水稻、玉米中研究结果一致［13-14］。从我们检测的几份不同糯高粱的突变类型来看，青壳洋和红缨子分别是泸州老窖和茅台酒生产重要高粱原料，而这2个厂家生产的白酒产品也都是中国高端白酒代表，这2个品种所携带的都是wxc突变型，与其它糯高粱多用wxa不同。是否Wx基因型的不同与白酒的品质相关，需要进一步验证。在株高方面，从我们鉴定结果显示出纯合dw2和dw3突变利用较为广泛，半数高粱品种利用了杂合型DW1/dw1。值得我们关注的是龙米粱1号、赤杂113以及赤杂109品种这3个品种株高基因型一致，仅携带DW1/dw1杂合型。3个品种整体上株高中等，赤杂109株高相对稍矮，表明可能还有其它株高基因如dw4参与株高的调控。青壳洋和红缨子株高都相对较高，与之相对应的是携带突变dw基因数目少。其中青壳洋不含已克隆的3个dw突变基因，红缨子仅携带纯合dw2。将来进行矮化育种改良时需有目标的聚合更多dw突变基因，如矮化红缨子需聚合非dw2株高突变基因。在Tan1调控单宁生物合成上，该调控基因的突变会造成籽粒单宁含量低［16］。仅发现有龙米粱1号携带tan1⁃b突变型，其它品种均不携带其纯合突变型。其中3份糯高粱冀酿2号、辽糯10以及晋糯3号携带了Tan1/tan1⁃b杂合型，表明该基因杂合型可能没有降低单宁含量的效应。在耐铝毒基因资源利用方面，可能由于此次试验选用的高粱品种没有在铝毒害严重的地区，检测的22份品种都不携带抗铝毒相关基因。在籽粒易消化上，仅有龙杂17品种携带有RA型支链淀粉酶基因，另外还有2个品种携带杂合型的GD/RA。提高高粱籽粒动物消化率，该基因是重要的选择目标。从目前看该基因的利用并不广泛，还有待充分利用的潜力。另一方面，本研究对检测生育期、株高等性状相关基因仅检测了22份推广材料，将来必须扩大检测范围、检测更多品种，研究结果才更具有说服力。在检测的基因型上，对不同突变基因进行更全面的检测，将对性状分析及育种研究具有更科学的指导意义，如株高的dw4基因以及单宁的tan1⁃a和tan1⁃b基因等。在检测手段上还主要以PCR产物测序为主，价格相对昂贵，将来有必要开发廉价、简便、易用的分子标记，以便更好的服务于育种。从水稻中糯与非糯控制基因Wx研究中已经发现了越来越多种突变类型，包括启动子突变、编码区突变等［20］。因此本研究有待商榷的地方是，我们检测的这几个基因不同的功能位点等位突变类型，未必包括所有可能突变，下一步有必要进行这些基因更多突变类型发掘，评估不同突变类型功能。将来还需要考虑不同性状基因之间的相互作用，确保更加精确、有效地进行分子育种。最后需要说明的是有些农艺性状的差别是基因转录水平差异造成的，进行基因表达量的筛选相对耗时、耗力。如耐铝品种因SbMate基因启动子上存在多个转座子MITE重复序列，造成基因转录水平高而耐铝毒。该基因的编码区在耐铝和铝敏感品种中不存在多态性。在该基因组上的内含子区域以及基因3’端存在与耐、敏感显著关联的SNP位点［21］，因此可以开发相应的引物进行鉴定。

在实验技术层面上，尽管PCR扩增技术非常成熟、简单，但有些基因扩增序列复杂性造成得到理想条带的难度很大，需要优化扩增体系等，最终才能得到理想的扩增结果。在这些检测的基因中其中Dw3基因由于有重复序列以及GC含量也高，扩增序列相对较长，尝试过多对引物设计，但结果仍不理想。我们从扩增体系入手，在PCR反应体系中间尝试添加甘油、甜菜碱等，期待降低扩增的难度，结果仍是不理想。于是在商业化生产中的PCR酶体系中，尝试过几种酶包括EX Taq、LA Taq（宝生物工程（大连）有限公司）、HIFI Taq（北京全式金生物科技有限公司）等，结果仍然不理想，最后筛选出一款采用KOD FX Neo Taq酶及其配套的2×buf⁃fer反应工作液（Toyobo 东洋纺（上海）生物科技有限公司），采用两步法最终获得较为理想的条带。

4 结论

中国8个省份共计22份推广高粱品种重要性状相关控制基因鉴定表明，糯高粱大多携带wxa等位基因，仅2份西南地方酿酒糯高粱青壳洋和红缨子包含wxc等位基因；开花期调控基因Ma1和Ma6的突变型利用较为广泛，而Ma2和Ma3的突变型在本文测试的品种中均未被利用；纯合dw2和dw3株高控制基因在测试品种中利用较多，而杂合型DW1/dw1也有半数测试高粱携带；仅龙米粱1号携带纯合tan1⁃b单宁基因型，部分品种携带杂合tan1⁃b基因型；支链淀粉酶SbPUL基因中，仅龙杂17携带纯合RA型基因，通杂136和赤杂109为杂合型GD/RA，其余品种均为GD型；所有品种不含有耐铝毒基因SbMate。