红棕象甲幼虫对吡虫啉敏感性测定及中毒行为学反应

张楚毓 ，袁伟钦 ，赵建超 ，李龙伟 ，吕朝军 ，陈拓 ，钟宝珠 ，覃伟权 *

（1.海南大学 热带作物学院，海南 海口 570100；2.中国热带农业科学院 椰子研究所，海南 文昌，571339；3.华中农业大学 植物科学技术学院，湖北 武汉 430070；4.云南农业大学 热带作物学院，云南 昆明 650000）

红棕象甲（Rhynchophorus ferruqineusFab.）是我国检疫性高风险有害生物［1］，对棕榈科植物危害极大，目前已传入大多数棕榈科引种区和分布区［2］。该虫以成虫在植物组织伤口、树冠芯部或叶基部产卵，卵孵化后幼虫取食茎干组织，最终导致植株在6~8个月内死亡［3］。目前红棕象甲已入侵到我国海南、广西、广东、云南、西藏（墨脱）、福建、江西、湖南、贵州、四川、重庆、上海、浙江、香港特别行政区、台湾等地［4］。红棕象甲防控技术研发在生物防治、化学防治及物理防治等方面均有开展［5-8］，其中化学防治应用最为广泛。吡虫啉是当前使用最广的新烟碱类药物，具有低毒、广谱、高效、速效、有效期长等特点［9］，其对天牛［10］、小蠹［11］、吉丁［12］、象甲［13］及木蠹蛾［14］等树干钻蛀性害虫均具有较好的防控效果，但害虫对该药剂的应激性反应还未可知。本文以红棕象甲7~8龄幼虫为供试对象，研究了吡虫啉对红棕象甲幼虫的毒力水平，并对处理后红棕象甲的行为学反应进行了记录和分析，以期为红棕象甲化学防治策略的制定和吡虫啉的科学利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试昆虫：红棕象甲为中国热带农业科学院椰子研究所昆虫繁育室自繁自养，继代不少于10代。试验前选用发育良好健康、外观无伤痕、活动力强的8龄幼虫供试。试验环境为（26±1） ℃、相关湿度70%±5%、光周期L∶D=16∶8。

供试药剂：吡虫啉含量为96%原粉，购自海南宏远达科技有限公司。使用前以丙酮为溶剂稀释至系列浓度备用。

1.2 试验方法

1.2.1 红棕象甲幼虫对吡虫啉的敏感性测定

用经口注射法。用移液枪分别将每头25、62.5、125、250、500 µg有效剂量从红棕象甲幼虫口腔注射入体内。为保证药液完全经口进入虫体，采用少量多次法（8~10次）将药液缓慢注射入试虫的口中。处理完成后将试虫分别转移至单独的饲养盒（φ4.5 cm×5.5 cm）中。每个浓度设置3个重复，每个重复20头试虫，以丙酮处理为对照组。处理后24、48、72、96 h统计试虫死亡率，以昆虫针触碰虫体无任何反应为死亡。

1.2.2 高剂量吡虫啉处理后红棕象甲幼虫中毒反应

处理方法同1.2.1。从药剂处理完毕后立即开始计时，至其完全丧失行动能力（用试虫针触动无移动反应）时停止。记录单头试虫在其间的症状表现：各状态保持30 s以上则被记录。记录时间秒钟（s）>30 s时舍弃秒钟单位数值，并在原分钟单位数值上加1，秒钟≤30 s则舍弃秒钟单位数值，原分钟单位保持不变。

1.2.3 低剂量吡虫啉处理后红棕象甲幼虫中毒反应

用经口注射法，用移液枪分别将每头1.5、1.75、2、2.25、2.5 µg的有效剂量药液从红棕象甲幼虫口腔注射入体内。其余处理方法同1.2.2。处理后每12 h观察一次，连续观察4 d，记录各试虫的症状表现。

1.2.4 吡虫啉处理下红棕象甲幼虫后期取食量

处理方法同1.2.1。处理后48 h对各试虫进行特异性应激反应观察，之后补充喂食去皮甘蔗段（φ 4 cm×3 cm）。取食量标准为：取食量<1%为无取食，10%>取食量≥1%极少取食，20%>取食量≥10%为轻微取食，30%>取食量≥20%为少量取食，取食量≥30%为明显取食。

1.2.5 数据处理方法

参照黄剑等［15］的方法分析毒力回归方程及LD50/LT50、LD50/LT50的95%置信区间。用Origin V.2021对数据进行图形绘制分析。

2 结果分析

2.1 红棕象甲幼虫对吡虫啉的敏感性测定

不同剂量吡虫啉处理红棕象甲幼虫的LT50结果如表1。在各供试剂量下，LT50的95%置信限重叠，LT50值无显著性差异。不同处理时间后，吡虫啉对红棕象甲幼虫的死亡率结果（表2）显示，在处理后24 h和48 h的LD50差异不显著，但均高于72 h和96 h，随供试时间延长，LD50呈现降低趋势，其中在处理后96 h的LD50为每头0.43 µg，与24 h和48 h处理组结果差异显著。

表1 吡虫啉不同剂量处理红棕象甲幼虫的LT50统计结果Table 1 LT50 of R.ferrugineus larvae treated with different dosages of imidacloprid

表2 吡虫啉不同时间处理对红棕象甲幼虫的LD50Table2 Statistical analysis of LD50 of R.ferrugineus lar⁃vae treated with imidacloprid after different time

2.2 吡虫啉处理后红棕象甲的行为学反应

吡虫啉处理后，红棕象甲中毒行为主要表现为：失禁、呕吐、胸部蜷缩、向背蜷缩、口器持续大张状态、S状蜷缩、L状蜷缩、C状蜷缩、全身蜷缩、钩状蜷缩、螺旋蜷缩、中部缢缩、尾部缢缩、长条状缢缩、体壁松软等，具体见图1。在各状态中，表现为中部缢缩、尾部缢缩、长条状缢缩这3种状态中的大部分试虫最终转变为胸部蜷缩状态。

2.2.1 高剂量吡虫啉处理后红棕象甲中毒行为学分析

吡虫啉在高剂量梯度（每头25~500 µg）中的最低剂量每头25 µg处理后，红棕象甲丧失行动能力时间平均为10.35 min（9 min 56 s~11 min），在供试较高剂量下，试虫丧失行动能力时间的时间跨度增加（1~30 min）。在所有的中毒状态中，试虫口器持续大张状态在各剂量中均大量表现。在最高剂量（每头500 µg）中呈现失禁状态的试虫数量显著多于呈现呕吐状态的个体数量，而较低剂量（每头25~62.5 µg）处理中则呈现相反结果。在各剂量处理中均有超过50%个体出现胸部蜷缩状态。在观察中统计发现，当虫体出现明显的呕吐、失禁、蜷缩、体壁松软状态后1~2 min 基本会完全丧失行动能力。药剂处理后期，供试较高剂量处理（每头250、500 µg的虫体在背中线部位出现羽状皱缩（如图1J），其它部位呈现球状凸起，个别虫体出现虫体爆裂后内容物崩出死亡（如图1K）。

图1 吡虫啉处理后红棕象甲幼虫的中毒行为学反应Fig.1 Behavioural response of red palm weevil larvae to imidacloprid treatment

2.2.2 低剂量吡虫啉对红棕象甲高龄幼虫处理后行为学观察

在经吡虫啉低剂量处理后红棕象甲幼虫亦会出现蜷缩、皱缩、抖动、口器持续大张、松软、平衡感缺失等中毒症状，各症状出现的先后依次为：胸部蜷缩、C状蜷缩、L状蜷缩、S状蜷缩、钩状蜷缩、螺旋蜷缩、向背蜷缩、全身蜷缩、口器持续大张、皱缩状态，最后进入体壁松软状态，在此之后会短暂随机出现抖动、张口、蜷缩等状态，并伴随个别虫体出现爬行失衡。所有出现蜷缩状态的个体均会有长短不一的体壁僵硬状态。在低剂量梯度下没有内容物崩出的现象出现。

出现蜷缩症状的试虫中，有70%以上个体前期仅胸部出现缢缩，处理后期胸部缢缩个体数量减少，并转化为其它蜷缩状态，而向背蜷缩的个体会身体后仰伴随大量排泄。

在试虫出现口器持续大张行为前期，部分个体会出现单个上颚开合，或双颚交叉快速高频率2~4次·s-1开合，此过程持续约5~30 min后即上颚间歇性大张持续2~3 d。

2.3 吡虫啉处理后红棕象甲幼虫反应剂量-时间效应关系

吡虫啉每头1.5~2.5 µg有效剂量处理后各试虫出现中毒反应的时间差异如图2所示。各剂量处理中红棕象甲幼虫出现抖动状态的个体比例均在24~36 h间达到最高，其中最高处理剂量（每头2.5µg）的个体数量较最低剂量（每头1.5 µg）的峰值高出30%，比例峰值出现时间提前12 h，并且在处理后24 h内各处理中均呈现上升趋势，之后下降并最终稳定在10%左右。处理后出现口器持续大张状态和体壁僵硬状态的个体比例均在12~36 h间达到峰值，其中最高处理剂量（每头2.5 µg）处理的峰值较最低剂量处理组（每头1.5 µg）的峰值高出20%，峰值出现时间延后12 h。此状态出现比例在各剂量处理后36 h均呈现上升趋势，之后整体呈现起伏下降的趋势。处理后体壁松软状态的个体比例除最高剂量（每头2.5 µg）处理在84 h达到峰值，其他浓度均在36~48 h间达到峰值。处理后平衡感缺失后恢复状态个体在12 h内时较少，最高剂量（每头2.5µg）处理组在所有时间内均未恢复。在48 h后再次喂食对口器持续大张状态以及平衡感缺失后恢复状态有较大的影响。

图2 相同剂量下不同时间各特异性状态分析Fig.2 Analysis of each specific state under the same dosage at different time

呈现各中毒反应的试虫个体比例峰值与首次谷值的浓度-时间表如表3所示。从表中可知，在行为表现中，抖动、口器持续大张、体壁僵硬状态在处理后峰值出现在24~36 h内，且比例均高于60%，首次谷值均出现在36~60 h之间，且比例均为0；体壁松软、平衡感缺失后恢复状态在处理后峰值出现在36~48 h，且比例均为50%，首次谷值均出现在24~36 h，且比例均为0。

除口器持续大张状态和体壁僵硬外，各特异性状态的首次谷值出现的浓度与峰值浓度对应相反；各特异性状表现所占比随时间的增长都出现了起伏式变化。

同时从表3和图2中还可看出，在各相同时间不同剂量处理的红棕象甲幼虫的应激反应表现为：在处理12 h后各不同浓度平均占比中抖动状态占比26%、体壁僵硬状态占比30%、口器持续大张为状态占比48%，这3个状态都有明显平均起始表现，占比都超过了25%，而体壁松软状态占比10%，平衡感缺失后恢复状态占比8%，这两个状态的平均起始表现都没有超过10%。处理后24~96 h各不同剂量平均占比中相较于12 h平均起始表现，抖动状态占比低9%，口器持续大张状态占比低15%，体壁僵硬占比低27%，体壁松软占比高6%，平衡感缺失后恢复状态占比高3%。

表3 呈现各状态的试虫个体比例峰值与首次谷值的剂量⁃时间表Table 3 Dosage⁃time table of the proportion of individuals with peak value and the first valley value in each state

2.4 吡虫啉处理对红棕象甲幼虫二次取食情况影响

48 h后喂食相同剂量下不同时间的取食情况分析见图3。结果表明，在除每头2.25 µg有效激励外，其它各剂量处理均在96 h达到峰值，其中各剂量处理无取食现象整体表现平稳呈现随时间的推移上升的趋势；处理后极少取食现象整体表现低迷呈现先上升后下降的趋势，整体稳定在0~20%，最终该现象消失在96 h；处理后轻微取食现象整体表现呈现下降趋势，除最高剂量每头2.5 µg外其他剂量处理有较高的取食行为表现，并在72 h后仅有每头1.5 µg处理有少量表现，最终逐渐消失；处理后少量取食现象整体表现明显呈现起伏上升趋势，每头1.75~2.25 µg剂量处理组有较高的取食行为表现；处理后明显取食现象整体表现起伏上升的趋势，每头1.5 µg处理组有较高的取食行为表现。

图3 48 h再次喂食后相同剂量下不同时间的取食Fig.3 Analysis of feeding conditions at the same dosage at different times after 48h re-feeding

48 h喂食后各取食情况峰值与首次谷值的浓度与时间表如表4所示，结果表明，根据相同浓度下不同时间取食情况曲线走势与喂食后各取食情况峰值与首次谷值比较可知在各取食情况中，无取食、极少取食、轻微取食、在中高剂量中表现明显，其中又以最高剂量每头2.5 µg的无取食状态表现突出，峰值达到了90%；少量取食、明显取食现象，在低剂量中表现明显，其中又以最低剂量每头1.5 µg处理组明显取食现象表现突出，峰值达到了60%。除轻微取食现象外，各取食情况的峰值与首次谷值对应相反，各取食情况的峰值表现的时间点都十分靠后，集中在84 h后；各取食情况的首次谷值表现的时间点都十分靠前，集中在60 h这个起始记录时间点。

表4 48 h喂食后各取食情况峰值与首次谷值的剂量-时间表Table 4 Dosage⁃time tables of peak value and first valley value in each feeding situation after 48 hours of feeding

3 讨论与结论

在经口注高剂量（每头25~500 µg）吡虫啉后红棕象甲大龄幼虫平均会在11 min之内丧失行动能力，并且随着处理的有效剂量越高，虫体会出现不同的耐受时间，从1~30 min不等，故而推测在高剂量出现不同的耐受时长与虫体个体差异有关。而在每头25 µg剂量下从注药到丧失活动能力的时长稳定在10~11 min的现象有待研究。吡虫啉与烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）结合后，干扰昆虫神经系统的刺激传导，引起神经通路的阻塞进而造成乙酰胆碱的蓄积，导致昆虫麻痹并出现典型的中毒症状：异常兴奋、痉挛、身体摇晃至衰竭死亡［16］。在经过本次试验的观察中在经口注射低浓度（每头1.5~2.5 µg）吡虫啉后红棕象甲大龄幼虫会在5 min内会出现明显的应激反应，最先出现的多是不同程度的蜷缩及体壁僵硬。随后1 h内能观察到移动平衡能力下降，移动活力逐渐丧失，会有虫体体壁僵硬与体壁松软不断反复的出现。处理后12 h内，所有剂量下的虫体都会出现排便失禁的情况并伴随着呕吐的发生。体壁僵硬状态会在各剂量各时间段有明显的表现，是吡虫啉喂毒后最明显的消极特异性状态。在处理后出现的抖动、口器持续大张、体壁僵硬、体壁松软、平衡感缺失后恢复等5种特异性状态中，大部分表现与吡虫啉的生物学作用及机制如阻断昆虫正常的神经传导，使昆虫异常兴奋，最终麻痹死亡相关。根据各特异性状态的整体表现，我们不难观察出各特异状态占比不论是平稳、上升还是下降始终表现出起伏式曲线，并且各特异性状态同时交替反复出现。

喂食后会促进虫体消化系统的功能运动。在大部分昆虫中肠肠道内存在围食膜，围食膜是半渗透性的，它可以允许营养物质、消化酶和防御因子的通过，但会阻止肠道上皮细胞与肠道微生物和有毒物质的直接接触［17］。在本次试验中48 h喂食后，口器持续大张状态出现了较为明显的减轻。同时可发现，喂食与否，于虫体的抖动、口器持续大张、体壁僵硬、体壁松软等消极特异性的表现强弱会根据剂量的高低呈现负相关性，剂量越高相关性越弱越不易受到进食的影响，剂量越低相关性越强越容易受到进食的影响而出现消极特异性状态的减弱或消失。前人结果表明，昆虫肠道是宿主与外部环境之间的重要交界面，栖息着大量的微生物［18］。肠道有益微生物参与宿主代谢，提供营养物质［19］，参与有害物质降解［20］。因此作者认为本研究中出现以上症状可能是因为喂食这一行为确实减轻了吡虫啉施药后的一些症状，但是并没有让所有的消极症状都有明显的改善，说明在吡虫啉施用后幼虫进食与否，在其整体的应激反应来看影响不大。

虫体体内的解毒酶，主要是解毒或代谢各种异种物质，在脂质代谢中也起着重要的生理作用［21-22］。相关研究表明害虫对烟碱类杀虫剂产生抗药性主要与害虫解毒代谢酶活性增强有关，其中P450s的改变被认为是主要原因，如烟粉虱对吡虫啉等烟碱类杀虫剂的抗性，与具有解毒作用的细胞色素氧化酶P450的过量表达相关［23］。通过本试验结果分析，红棕象甲施用吡虫啉后，整体上该虫在各浓度的消极表现会随着时间的增长而减轻，相对应的积极影响也在同时随时间的增长出现增加的趋势。

目前，采用化学防治技术控制红棕象甲，仍是治理红棕象甲危害的重要且有效的应急防控措施［24］。在本研究中我们也发现了红棕象甲幼虫对吡虫啉的应激反应总体上与吡虫啉的生物学作用与机制相关，并且在一定浓度下红棕象甲幼虫有一定的排毒解毒的恢复能力，相关研究结果对于红棕象甲等钻蛀性害虫的防治以及树干注射药物的研发等具有一定的借鉴意义。