GFP唾液乳杆菌CCFM6105的构建

高彤 李明桂 梁水明 范丽佳 王长丽

摘 要：目的：构建、筛选并鉴定出重组GFP唾液乳杆菌CCFM6105。方法：利用GFP作为报告基因，从携带gWizGFP质粒的大肠杆菌中提取质粒，将gWizGFP质粒电转化至唾液乳杆菌CCFM6105中，构建GFP唾液乳杆菌。结果：PCR产物电泳结果显示约在750bp处出现明亮条带，PCR反应成功；在1800V电压下的菌落荧光暗沉；在2400V电压下的菌落荧光致密明亮；在2200V、2600V电压下菌落荧光偏暗；各代重组菌的GFP表达良好且无明显减弱。结论：本实验成功构建GFP唾液乳杆菌CCFM6105且GFP在唾液乳杆菌在稳定遗传中得到了稳定的表达。

关键词：唾液乳杆菌；绿色荧光蛋白；电转化

Construction of GFP Lactobacillus Salivarius CCFM6105

Gao Tong1 Li Minggui1 Liang Shuiming1 Fan Lijia1 Wang Changli2*

1.Youjiang Medical College for nationalities，School of clinical medicine GuangxiBaise 533000；

2.Youjiang Medical College for nationalities，Medical laboratory College GuangxiBaise 533000

Abstract：Objective：To construct，screen and identify recombinant GFP Lactobacillus salivarius CCFM6105.Methods：using GFP as the reporter gene，the plasmid was extracted from E.coli carrying gWiz GFP plasmid，and the gWiz GFP plasmid was electrotransformed into L.salivarius CCFM6105 to construct L.salivarius GFP.Results：The electrophoresis results of PCR products showed that a bright band appeared at about 750bp，and the PCR reaction was successful；Colony fluorescence darkening at 1800V voltage；The colony fluorescence was dense and bright at 2400V voltage；The colony fluorescence was dark at 2200V and 2600V；The expression of GFP in the recombinant strains of each generation was good without obvious weakening.Conclusion：In this experiment，GFP in L.salivarius CCFM6105 was successfully constructed and GFP in L.salivarius was stably expressed in the stable genetic.

Keywords：Lactobacillus salivarius；Green fluorescent protein；Electroconversion

乳酸桿菌（Lactobacillus，Lac）是一类能利用糖类产生乳酸的细菌，且可与人或兽在体内长期共存的一种微生物，其对肠道上皮细胞具有很强的黏附力，具有促进机体体液和细胞免疫、调节肠道菌群、维持菌群微生态平衡的作用［13］。乳酸菌作为可食用益生菌，它的益生功能与其能否通过口服进入动物体内及运动分布情况密不可分。目前，对乳酸杆菌的研究主要集中在宿主生理和微生物菌群变化上，尚缺乏对菌株进入肠道后分布、运动及其定植的系统的针对性研究。细菌质粒是基因工程中最常用的载体，它可以将目标基因携带到受体细胞中，促进目标基因在受体中的表达［2］。绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，简称GFP）是一种实验中常用的报告基因，分子量通常较小。因其能与多种蛋白质端结合且不破坏原始蛋白、细胞上可稳定表达、荧光强且易于检测等一系列优良特性，故GFP是一种理想实验观察效果极佳的荧光标记物［2］。国内已有大量研究学者对GFP进行广泛且多维度的实验室应用：萨初拉［4］等采用GFP作为报告基因为构建植物乳杆菌高效特异表达载体；方来杉［5］等利用GFP作为标识研究乳杆菌在疫苗制备的用途等相关领域的研究，在GFP的标识下均取得了不错的实验观察效果。因此，本研究将经过GFP基因修饰的质粒利用电转化法转入Lac中，构建GFP唾液乳杆菌，为研究唾液乳杆菌定植、动态监测和口服免疫机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验菌种、主要试剂、培养基和仪器

唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）CCFM6105、携带gWizGFP质粒且具有卡那霉素抗性的大肠杆菌DH5α、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、PBS液、卡那霉素、限制性核酸内切酶（BamH I和Sal I）、蔗糖、甘油、SMRS培养基、LB培养基、MRS培养基。电转化杯（规格0.2cm）、购自BioRad公司的电穿孔仪、LRH250型生化培养箱、恒温培养箱和水浴锅、冰盒、XS212型光学显微镜、PCR仪、TDL5型台式离心机、共聚焦显微镜。

1.2 携带gWizGFP质粒的大肠杆菌的活化和复壮

取携带在-80℃冰箱中gWizGFP质粒的大肠杆菌甘油管（菌液∶甘油=1∶1）进行活化和复壮，取复壮后菌液于超净工作台内转接至100mL/250mL LB培养基，37℃、160r/min震荡培养至对数生长期。取100μL原始菌液，对试管依次标记：试管1—6，稀释浓度：10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。取100μL稀释后菌悬液涂布在含Kanr培养皿（每个梯度3个），恒温过夜培养。36h～48h后，挑选培养基内长势较好菌落数在30～300范围内的进行传代培养。

1.3 提取大肠杆菌的gWizGFP质粒

添加50μL/mg LB培养基培养过夜，取OD600≥1.6状态下的大肠杆菌菌液提取质粒备用。试剂盒提取质粒gWizGFP作为模板，GFPup和GFPdown为引物进行扩增，具体扩增程序参照杨明阳［6］、张莹［7］等实验内容，应用电泳检测扩增产物。

设计引物、PCR扩增GFP基因片段、测序鉴定：登录GenBank中查询GFP基因（GFP）的开放阅读框架（ORF）序列信息，分析（图1）选取存在gWiz质粒上启动子后限制性核酸内切酶（BamH I和Sal I），酶切位点插入引物两端，添加保护序列。应用primer5.0设计1对特异性引物进行验证：

1.4 唾液乳杆菌感受态细胞的制备及电转化实验

感受态细胞的制备详细参照方来杉［5］、张莹［7］等实验，电转化实验在其他条件不变的情况下电压设置四个梯度（1800/2000/2400/2600V），确定唾液乳杆菌最适的转化电压。电转化对阳性转化子（在荧光显微观察有荧光的菌落则为阳性）进行计数，计算出四个电压梯度下的转化效率并分析。

1.5 检测构建的GFP唾液乳杆菌的纯化度与稳定度

通过稀释法把菌液用NS进行稀释，取10-1、l0-4、10-6稀释度的菌液少许均匀涂在有抗体的MRS平板上。在37℃厌氧条件下培养36～48h，观察并挑选长势良好的转化子继续培养10代，纯化筛选出稳定表达绿色荧光的唾液乳杆菌。

2 结果

2.1 gWizGFP质粒的大肠杆菌的活化与复壮结果

连续传代结果表明：大肠杆菌从第1—4代培养基的生长速度稍慢，需要24～36h才能生长出明显的菌落。随着菌株继代培养，生长速度显著加快，第8代后约12～16h可见清晰的菌落。挑选生长良好的gWizGFP质粒大肠杆菌进行液体震荡培养，随着时间的增长，通过图2可以看出，培养基中菌落的生长规律表现为先上升后趋于平稳，当OD值<6h时，出现一个生长期，缓慢增加；当6h<OD值<18h时，呈对数期快速增长，OD值>18h后增长速度逐渐达到平稳期，菌落的活性逐渐恢复。

2.2 在大肠杆菌中GFP基因的遗传与表达情况

如图3所示，可在共聚焦显微镜下观察到携带gWizGFP质粒的大肠杆菌活化后的GFP能够稳定表达，表明大肠杆菌的活性得到很好的恢复。

2.3 GFP基因的擴增结果

如图4所示，PCR反应中出现了双酶切质粒、扩增验证GFP条带、另有一条清晰条带在约5000bp处、一条约750bp处。750bp处出现与预期片段大小一致的明亮条带，说明PCR反应成功，测定PCR产物与T载体的结果与GeneBank中GFP序列达100%。

2.4 唾液乳杆菌的电转化结果

图5所示，唾液乳杆菌在其他条件不变的情况下，在1800V电压下的菌落荧光暗沉；在2400V电压下的菌落荧光致密明亮；在2200V、2600V电压下菌落荧光偏暗。由图6可看出，故电转化效率在2400V时最高，表明该电压为本实验电转化实验的四个电压中最适转化电压。

2.5 转化子的荧光蛋白表达情况

把1—8代的转化子液体震荡培养，取OD=0.6的菌液稀释10-2倍，将稀释后的菌液滴在3个玻片上进行荧光检测，把每个在显微镜下玻片的视野均等划分为25块，每个视野随机取1块，计算3块视野的取样平均值绘图（图7）比较发现，1—8代转化子在共聚焦显微镜下GFP表达良好，表明在菌株的繁衍过程中GFP的表达未出现明显的渐弱或丢失，工程菌株构建成功。

3 讨论

唾液乳杆菌是一种细胞壁较厚的革兰氏阳性菌，外源DNA转移到唾液乳杆菌的效率低下［8］。利用电转化法可以提高外源DNA转移到唾液乳杆菌细胞转化效率，并且相对稳定［9］。细胞膜表面在电击时会形成临时孔隙，外来分子可经孔隙进入受体细胞，若电压过低，在细胞膜上难以形成适配的孔隙，外来分子难以转入；电压过高，细胞膜上形成的孔隙因增大而造成细胞膜通透性增加，外来分子更易进入细胞；而超过细胞的承受力的电压则直接导致细胞破裂死亡［1011］，所以适当的电压刺激至关重要。目前，大多数实验者使用1600V到7kV的电压，唾液乳杆菌一般在2400V～3200V电压下，可以取得较好的转化率［8］。近年来，通过优化电转化方法，各类细菌的电转化所需电压存在明显差异。韦云莹等［12］利用响应面法优化发酵乳杆菌的电转化条件，其中电压强度为15kV/cm；在10kV/cm时，乳酸乳球菌NZ9000的电转化效率达到最佳［13］。乳酸菌种类繁多，有研究发现在同样的参数下，不同乳酸菌的最佳电转化效率亦不尽相同，譬如唾液乳杆菌AR809与AR612相比，转化效率差异明显［9］，不同菌种的转化能力差异或与菌株的特异性有关；同时乳酸菌的电转化效率亦受质粒浓度的影响，在一定浓度范围内质粒浓度提高，电转化效率亦相对应地提高，当转化效率超过一定范围后会有不同程度的降低［1213］。综上，乳杆菌的电转化需要依据具体的菌株设立有效的转化方法，除上述因素外，影响电转化效率的因素还包括细菌的生理状态、复苏时间、质粒大小等。

本研究构建出了携带gWizGFP基因的唾液乳杆菌，结果表明重组的菌株在遗传8代仍能稳定表达，但重组菌进入机体后是否会影响细菌本身的复制以及GFP的表达都还未可知，有待深入实验考究。

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基金项目：广西高校中青年教师基础能力提升项目（2020KY13007）；自治区教育厅2021年和2022年创新创业训练计划项目（S202110599090、S202210599042）；右江民族医学院2021年度校级科研课题（yy2021sk063）；2021年右江民族医学院“新启航”青年骨干项目

作者简介：高彤（2000— ），女，广西桂林人，本科在读，研究方向：临床医学。

*通讯作者：王长丽（1992— ），女，广西南宁人，研究生，讲师，研究方向：基础医学、微生物资源挖掘与利用。