叶面喷施脱落酸对黄瓜果实品质的影响

梁 颖, 张泽锦, 王力明, 唐 丽, 高 佳

(1.四川省农业科学院园艺研究所/蔬菜种质与品种创新四川省重点实验室, 成都 610066; 2.农业农村部西南地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室, 成都 610066; 3.四川省农业科学院农产品加工所, 成都 610066)

【研究意义】黄瓜(CucumissativusL.)是中国设施蔬菜的主要栽培作物,在全国各地广泛种植。黄瓜幼苗在定植后容易受到干旱[1-2]、高温[2-3]等胁迫,其产量和品质受到严重影响,因此在黄瓜生长过程中常通过外源添加植物生长调节剂,如脱落酸(ABA),来改善植物的抗逆性[3-4]。ABA是调控植物生长发育过程的重要内源性激素,也是调控植物响应外源胁迫的关键因子,ABA能够通过提高抗氧化酶类活性缓解胁迫效应,促进植物对外源环境的抗逆性,同时也能够通过内源合成、信号转导以及和其他激素互作等多种途径调控次生代谢物质的合成[5-6]。此外,成熟果实中也会产生大量ABA,对果实发育成熟有重要的作用[7]。【前人研究进展】近年来,国内外关于外源ABA对果实品质影响的研究日益深入。研究发现,外源ABA对果实发育成熟过程中多个方面起调控作用。在葡萄、苹果、蜜柚以及番茄等相关研究中发现,外源施用ABA可以显著提高果实重量、可溶性糖含量及果实硬度等,增加色素物质如花色苷的累积,但是会减少类胡萝卜素的合成[8-13]。对西瓜中的研究发现,外源施用ABA提高果实可溶性固形物含量,果实硬度却显著降低[7]。在欧李中的研究发现,采前喷施ABA对欧李果实品质的调控作用不仅受到ABA浓度和喷施次数的影响,不同品种间也存在显著差异[14]。在葡萄中利用转录组测序发现ABA通过调控花青苷合成和转运相关基因来促进葡萄花青苷的积累,同时筛选出可能参与调控这个过程的15个关键转录因子[15]。在蓝莓中通过转录组测序技术筛选获得参与蓝莓成熟着色的关键转录组因子VcMYBA[16]。在番茄中发现外源ABA可能通过诱导芳香物质次生代谢途径中关键基因的表达促进番茄果实中芳香物质的合成[17]。Chen等[18]通过转录组分析揭示了外源生长素和外源ABA通过RLKs激酶以及相关的激素信号转导途径调控草莓成熟的机理。以上结果表明,通过转录组测序分析不同外源ABA处理条件下果实基因表达差异及调控模式差异,可以筛选关键调控基因,挖掘ABA调控果实发育的深层机理[19]。【本研究切入点】 黄瓜的特征风味物质主要为2E,6Z-壬二烯醛和2,6-壬二烯醇,2E,6Z-壬二烯醛是主要的特征风味物质[19],是影响黄瓜品质的重要指标。目前关于黄瓜施用外源脱落酸的报道大多集中在ABA对黄瓜抗逆性的影响[20-21],很少有研究关注叶片喷施ABA对黄瓜果实品质的变化。【拟解决的关键问题】本研究以华北型黄瓜‘川翠13号’为研究对象,通过叶面喷施ABA,测定黄瓜果实品质,并通过转录组测序揭示调控黄瓜果实相关基因表达的变化,为外源喷施ABA影响黄瓜果实品质提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为‘川翠13号’黄瓜品种,购自成都好特园艺有限公司。ABA为分析纯,购自飞净生物科技有限公司。

1.2 试验处理

试验于2021年3—5月在四川省农业科学院现代农业科技创新示范园(四川省,成都市)大棚内进行。2021年3月,挑选籽粒饱满的黄瓜种子进行催芽,待露白后播种于32孔穴盘中,自然光条件下育苗3周后,选择整齐一致的黄瓜幼苗移栽至塑料大棚中进行水培,营养液采用山崎营养液配方[22]。当黄瓜果实长度约为10 cm时(开花后1～2 d),以第3节黄瓜果实为试验对象,用塑封袋套住果实进行遮挡,对黄瓜第3节瓜处以及上下各1片叶(共3片叶)进行ABA处理。试验共设5个处理,分别喷施0(CK)、50(T1)、100(T2)、200(T3)和400 μmol/L(T4)的ABA溶液,以滴水为度,正反两面喷施。每个处理4株黄瓜植物,重复3次。处理后1周采取果实并保存于液氮中用于转录组测序和后续品质测定。

1.3 测定指标和方法

1.3.1 品质指标测定 黄瓜品质指标参照李合生[23]的方法进行测定,其中可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定,抗坏血酸含量采用二氯酚靛酚滴定法测定。

黄瓜风味物质反,顺-2,6-壬二烯醛含量参考刘春香等[24]的方法稍作改进进行测定。称取5 g冻样黄瓜粉末到顶空瓶中,采用顶空微固相萃取与气质联用仪,利用选择离子扫描技术测定黄瓜中特征风味物质反,顺-2,6-壬二烯醛的含量。以反,顺-2,6-壬二烯醛为标准品建立标准曲线,计算样品中反,顺-2,6-壬二烯醛的含量。75 μm聚二甲基硅氧烷(Polydim ethylsiloxane,PDMS)萃取头。色谱条件:色谱柱HP-5MS(30 m0 mls mmmmlsi,μm);进样口温度250 ℃,接口温度250 ℃;分流比12∶1;载气为高纯氦气,恒流流速1.0 mL/min;升温程序:起始温度36 ℃,然后以12 ℃/min的速率升至60 ℃,再以6℃/min升至140 ℃,最后以20 ℃/min升至240 ℃,保持10 min。质谱条件:离子源温度200 ℃,电离方式EI,电子能量70 eV。

1.3.2 黄瓜果实总RNA提取、文库构建、转录组测序以及差异表达基因筛选 黄瓜果实的总RNA提取方法参照RNAplant Plus Reagent DP437(天根,北京,中国)方法进行,采用Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)检测RNA浓度及纯度,采用试剂盒VAHTS mRNA-seq V3 Library Prep Kit for Illumina(Vazyme,北京,中国)构建cDNA文库。由派诺森公司(http://www.personalbio.cn/)完成测序,测序平台为illumina Novaseq 6000。样品上机测序获得的原始数据(RAW reads)进一步过滤,去除一些带接头、低质量的reads从而获得Clean reads。利用HISAT v2.0.4将Clean reads与对黄瓜的参考基因组进行序列对比[25]]。利用BLAST进行基因功能注释[16-17,26-27]。利用DESeq软件获得差异表达基因(FDR<0.05, |log2FC| >2)。GO(Gene ontology)功能富集分析采用topGO进行[28],KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析使用OmicShare tools (www.omicshare.com/tools)完成。

1.3.3 qRT-PCR方法验证RNA-seq结果 随机选取10个差异表达基因进行qRT-PCR分析,用于验证RNA-seq结果。使用微孔板紫外分光光度计(TECAN,infinite M200 Pro,Switzerland)检测RNA浓度和质量,然后对总RNA进行反转录,反转录使用cDNA合成试剂盒(Tiangen)。以CsEF1A为看家基因(Csa_2G139820),使用荧光定量PCR仪(Bio-Rad,CA,USA)检测基因相对表达量。PCR反应包括95 ℃ 3 min以及40个循环95 ℃ 15 s,62 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s。特异性引物如表1所示。

表1 qRT-PCR引物Table 1 Primers used for qRT-PCR

1.4 数据分析

使用SPSS 26对数据进行统计处理和方差分析,使用Sigmaplot 14以及Adobe Illustrator 6.0进行绘图。

2 结果与分析

2.1 叶片喷施不同浓度ABA处理对黄瓜果实品质的影响

从表2可知,叶面喷施ABA可显著提升黄瓜果实可溶性糖含量。与CK相比,叶面喷施不同浓度ABA,黄瓜果实可溶性糖含量分别增加47.35%、16.50%、4.16%和5.79%。黄瓜果实抗坏血酸含量则随着ABA浓度增加呈先增加后降低趋势,T1、T2、T3处理的抗坏血酸含量较CK分别增加60.49%、63.49%和65.08%,而T4处理的抗坏血酸含量较CK下降62.08%。但是喷施不同浓度的ABA均可降低黄瓜风味物质反,顺-2,6-壬二烯醛含量,与CK相比,T1、T2、T3和T4处理分别下降44.24%、30.09%、26.67%、42.58%。说明,叶面喷施ABA可以促进黄瓜可溶性糖和抗坏血酸含量的积累,但是降低黄瓜风味物质反,顺-2,6-壬二烯醛的积累。T4处理中黄瓜的风味物质和抗坏血酸含量都显著降低,为了进一步解析外源ABA对黄瓜果实营养品质的影响,选择T4处理作为研究对象进行下一步分析。

表2 叶片喷施ABA对黄瓜品质的影响Table 2 Effect of foliar ABA application on qualities of cucumber

2.2 黄瓜果实的转录组分析概况

从表3可知,经过测序,黄瓜果实获得共计261 364 680条原始数据,经过质量剪切过滤后获得237 831 174条序列,占总reads数的91%。GC含量为42.23%～43.78%,Q20值和Q30值分别为97.44%～97.62%和92.94%～93.58%,说明测序质量较好,可以用于后续分析。将过滤后数据与黄瓜的基因组进行比对,序列的匹配度为95.73%～96.25%,因此,测序结果可靠程度较高。

表3 转录组测序质量Table 3 Qualities of the RNA-seq

2.3 黄瓜果实基因差异性表达分析

将CK和T4处理进行基因差异表达分析,从图1A～B可知,叶片喷施ABA后,黄瓜果实共检测到169个基因差异表达,其中有75个基因下调表达,占基因差异表达的44.38%,基因上调表达有94个,占基因差异表达的55.62%。从图1-C可知,差异表达基因在3个重复之间的表达趋势基本一致,说明叶面喷施ABA影响了黄瓜果实基因转录水平的表达。

A为差异表达基因的数量统计图;B为差异表达基因的火山图;C为差异表达基因相对表达量的热图。A showed the numbers of the DEGs numbers; B showed the volcano map of the DEGs; C is the normalized expression level of the DEGs.图1 叶片喷施ABA黄瓜果实中的差异表达基因Fig.1 Differentially expressed genes of cucumber fruits in response to foliar ABA application

2.4 黄瓜果实差异表达基因的GO富集分析和KEGG通路分析

GO功能富集分析表明,CK和T4处理的黄瓜果实差异表达基因主要富集在转录调控过程(图2-A)。此外,GO功能富集还包括一些生物合成过程,如调控大分子生物合成、芳香物质合成以及杂环合成等。

为了进一步分析预测差异基因的生物功能,对CK和T4处理的黄瓜果实差异基因进行KEGG富集分析(图2-B),发现差异表达基因富集的主要通路包括植物激素信号转导、苯丙氨酸代谢、类胡萝卜素代谢以及花生四烯酸代谢,说明叶面喷施ABA可能影响黄瓜果实的苯丙氨酸代谢、类胡萝卜代谢和花生四烯酸代谢,并可能通过改变激素信号途径调控黄瓜果实品质。

图2 黄瓜果实差异表达基因GO功能分析和KEGG通路富集分析Fig.2 Gene ontology (GO) enrichment and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) pathway enrichment of the DEGs of cucumber fruits

2.5 黄瓜果实差异表达转录因子分析

GO功能注释分析发现,黄瓜叶片喷施ABA后黄瓜果实的差异表达基因主要参与转录调控,因此对差异表达的转录因子进行分析(图3)。黄瓜果实差异表达的基因中有44个基因(26%)功能注释为转录因子,主要包括bHLH转录因子、bZIP转录因子、锌指蛋白转录因子C2H2和C3H、MYB相关转录因子以及NAC转录因子。喷施ABA后黄瓜果实的bHLH转录因子、bZIP转录因子基因表达均上调,锌指蛋白转录因子C2H2和C3H中有3个基因表达上调,3个基因表达下调;MYB相关转录因子有3个基因表达上调,2个基因表达下调;而NAC转录因子有2个基因表达上调,4个基因表达下调。这些转录因子的差异表达说明叶片喷施ABA影响黄瓜果实中转录因子的表达。

图3 外源ABA处理黄瓜果实中差异表达转录因子汇总分析Fig.3 Expression profile of transcription factor in response to foliar ABA application

2.6 黄瓜果实差异表达基因的qRT-PCR分析

随机选择黄瓜果实10个差异显著基因进行qRT-PCR分析,并与这些基因的RNA-seq结果进行比较(表4),选取的基因在2种分析方法下,表达趋势一致,说明RNA-seq结果的可信度较高。

表4 差异表达基因qRT-PCR结果Table 4 qRT-PCR results of the differential expression genes

3 讨 论

果实品质是衡量园艺作物商品性最重要的指标之一,其主要包括可溶性糖、维生素C以及风味物质等。ABA是一种重要的植物激素,在果实成熟过程中起重要作用。目前,关于外源ABA对植物果实品质的影响研究较多,例如,曲文颖等[29]研究发现,喷施ABA可以提高蓝莓果实中的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、花色素苷含量,然而对蓝莓维生素C含量影响不显著。王星辰等[9]对着色期苹果喷施ABA后,发现果实中可溶性糖含量显著提高。Balate等[13]研究发现,喷施和根灌ABA均能提高番茄果实可溶性固形物含量和固酸比。然而,喷施ABA后,欧李果实的可溶性固形物含量、可滴定酸含量、类黄酮含量、总酚含量以及抗氧化能力都显著降低[14],说明ABA对果实品质的影响具有物种差异性。本研究中叶面喷施一定量ABA可以提高黄瓜的可溶性糖含量以及抗坏血酸含量,这与曲文颖等[29]的研究结果相似,可能是因为外源施用ABA可以促进黄瓜果实内源ABA的积累,从而增加了糖分的运输和积累导致的[23],然而本研究发现,ABA浓度高于400 μmol/L(T4)时,抗坏血酸含量反而降低。独特的风味是黄瓜的重要特征之一。黄瓜风味品质在很大程度上决定于黄瓜浓郁的清香气息,其最重要的物质是反,顺-2,6-壬二烯醛,其含量越高,黄瓜风味越浓郁[30]。本研究发现,喷施ABA抑制了黄瓜风味物质反,顺-2,6-壬二烯醛的累积。说明,叶片喷施一定浓度的ABA可促进可溶性糖和抗坏血酸含量的累积,但是会抑制风味物质的累积。

ABA作为一种植物激素,可以用过调控转录因子的活性调控下游基因的表达[6]。转录因子通过与DNA特异性结合调控下游基因的表达,参与植物的生长发育过程。通过转录组分析发现,黄瓜叶片喷施ABA后,黄瓜果实中大量转录因子转录水平的表达发生变化,包括锌指蛋白转录因子(C2H2和C3H)、bHLH转录因子、MYB相关转录因子、bZIP转录因子以及NAC转录因子等。锌指蛋白构成了最大的转录因子家族之一,根据保守区域可以分为9个亚家族,包括C2H2(Cys2/His2)、C3H、C3HC4、C2HC5、C4HC3、C2HC、C4、C6和C8。C2H2是研究最多的锌指蛋白,C2H2锌指蛋白在植物非生物胁迫中有着重要的作用,包括在盐分胁迫、渗透势胁迫、冷胁迫、干旱胁迫、氧化胁迫以及高光胁迫中都起重要作用,C2H2锌指蛋白通过与ABA信号通路相互协调、相互促进来调控植物对非生物胁迫的响应[31]。C2H2和C3H转录因子中有3个基因表达上调,3个基因表达下调,说明外源ABA处理影响黄瓜果实胁迫响应基因的信号通路。此外,NAC转录因子是植物特有的一类转录因子家族,主要调控植物生长发育和非生物胁迫响应[32]。碱性亮氨酸拉链(bZIP)是一类广泛存在于真核生物中的转录因子,主要参与了植物的生长发育、环境因子介导的信号转导过程以及胁迫响应[33]。叶片喷施ABA后,这类转录因子的表达水平都发生显著变化,进一步说明ABA对胁迫响应信号通路的调控作用。bHLH转录因子、MYB转录因子以及WD40蛋白构成MBW蛋白复合体,在植物生长发育以及次生代谢产物合成途径的调控过程中发挥着重要的作用[34]。本研究中,bHLH转录因子表达量均上调,MYB转录因子2个上调,1个下调。转录因子的差异表达说明叶片喷施ABA可能通过调控黄瓜果实转录水平的表达,从而影响黄瓜代谢产物的合成。

4 结 论

外源喷施ABA后,通过调控植物次生代谢产物合成的相关因子,增加黄瓜果实可溶性糖含量的累积,但是风味物质的累积显著降低。此外,外源ABA浓度增加会引起黄瓜抗坏血酸含量降低。在生产中,通过外源喷施ABA提高黄瓜抗逆性需要选择合适浓度,本研究结果表明,施用50 μmol/L的ABA对黄瓜品质影响较小。