内生真菌Y118对促进两面针生长和品质提升的效应

谢泽碧,梁子宁,李 斌

(广西中医药大学,南宁 530001)

【研究意义】两面针[Zanthoxylumnitidum(Rox.) DC]是广西地道药材,为芸香科花椒属植物[1-3],具有镇痛活络、祛瘀活血和驱散风邪等功效[4-5]。两面针富含多种抗肿瘤活性成分,如氯化两面针碱[1]、白屈菜红碱[6]、别隐品碱、盐酸血根碱和芝麻素等,具有较高的抗菌、抗炎、抗氧化和镇痛活性[7]。其中,氯化两面针碱已被中国药典收录[1]。近年来,随着农林产业结构的不断调整,毁林开荒种植经济果林活动日益频繁,两面针的生境受到严重破坏,加上被过度采挖导致资源急剧下降,严重影响以其为原料的中成药及其相关产业的生产,而由于两面针为多年生植物,人工栽培面积暂时未能满足市场需求[8]。最新研究发现,内生菌菌肥可维持和提高土壤肥力、改善土壤结构、促进植物生长发育及提升抗病害能力[9]。两面针种植时间长,易受环境污染影响,但经济附加价值较高,应用微生物菌肥进行两面针提质增效将是两面针增产增收的有效手段。因此,分析内生菌肥对促进两面针生长和品质提升的影响,对提高两面针药材的综合效益具有重要意义。【前人研究进展】内生菌菌肥在植物抗病虫害、保产和增质方面具有突出效果,在中药材栽培中已得到广泛应用。林燕青等[10]研究发现,利用从木麻黄(CasuarinaequisetifoliaForst.)各组织器官中分离与纯化得到的内生真菌制作的水培苗浸泡菌液,能显著增加苗木的平均抽梢量,促进水培苗生长,其中,菌株18处理下苗木的平均抽梢量为54.85 cm,是对照苗木的7.62倍。熊春霞等[11]研究表明,含细黄链霉菌的激抗菌968对提升延胡索(CorydalisyanhusuoW.T.Wang)生长发育、单株产量和单株有效药用生物碱延胡索乙素含量的效果最佳。夏伟等[12]研究表明,分离自地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.ex Fisch.et Mey.)不同部位内生真菌诱导子可促进怀地黄组培苗生长,并提高其次生代谢产物含量。伍晓丽等[13]研究认为,从青蒿(ArtemisiaannuaL.)侧枝中分离获得的内生真菌(深绿木霉)液体发酵菌丝体在4—5月对青蒿幼苗生长具有显著促进作用,因此,深绿木霉可作为青蒿苗肥及与化肥配合施用于成株。迟惠荣等[14]从多花黄精(PolygonatumcyrtonemaHua)的根、茎、叶内分离出具有拮抗作用的内生菌株ZJU-3,通过温室栽培试验发现该菌株对多花黄精具有显著促生效果。何嘉等[15]探究不同微生物菌剂处理对枸杞(LyciumbarbarumL.)树体生长发育及果实产量和品质的影响,结果显示,各处理枸杞果实内含物多糖、甜菜碱和总黄酮含量分别较对照显著提高4.55%～25.00%、25.50%～43.67%和12.50%～58.00%,胡萝卜素含量提高达2.8～3.6倍,提升了果实品质。【本研究切入点】目前,虽有大量研究结果显示微生物菌肥在中药材增产和品质提升方面表现出优良特性,但尚未见微生物菌肥尤其是两面针内生真菌Y118在两面针种植管理中应用的报道。【拟解决的关键问题】以两面针和其内生真菌Y118(Phomopsissp.)为试验材料开展盆栽试验,分析其株高、鲜重、茎基宽和根的产量等生长指标,测定其根部的氯化两面针碱和白屈菜红碱含量,综合评价内生真菌Y118对两面针品质和产量的影响,以期为微生物肥料在两面针及其他药材种植上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2021年4月至2022年6月在广西中医药大学植物培养室进行。盆栽试验用两面针材料为广西中医药大学梁子宁研究课题组经组培、炼苗获得的幼苗。两面针内生真菌Y118为半知菌亚门拟茎点眉属真菌,由广西中医药大学梁子宁研究课题组前期从广西产两面针原植物叶片分离得到[16]。

主要仪器与试剂:Agilent 1260高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司)、ES2220M分析天平[(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)]、KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、氯化两面针碱对照品(批号为MUST-21101707,纯度≥99.81%,成都曼思特生物科技有限公司)、白屈菜红碱对照品(批号为RP200514,纯度≥99.77%,成都麦德生科技有限公司)、三乙胺(色谱级,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)、磷酸(色谱级,天津市科密欧化学试剂)及乙腈和甲醇[色谱级,赛默飞世尔科技(中国)有限公司)]等。

1.2 试验方法

1.2.1 固体发酵培养基制作 参考秦秀丽等[17]的方法,固体培养基按一定配方比例组成(以麦片和大米为载体,加入一定量的麦芽糖、蛋白胨和KH2PO4等,料水比为1∶1),内生真菌Y118经PDA培养基活化培养3～4 d,每60 g固体培养基接入1块直径约1.5 cm的菌饼,25 ℃发酵培养40 d,制作成固体发酵培养基,备用。

1.2.2 菌苗共培养 选择统一株高(约5.0 cm)、叶片数3～5片的两面针幼苗,移栽于内径15.5 cm、高14.0 cm的塑料花盆,每盆用基质土(广西中医药大学松树林下疏松泥土)种植1株。移栽后10～15 d,幼苗生长稳定后开始设置真菌Y118处理和对照(CK)2个处理,每个处理3个重复,每个重复10盆。其中,真菌Y118处理每株施加25 g固体发酵培养基,CK每株施加25 g未加菌的固体发酵培养基进行培养。移栽后浇透水,养护过程中每天定时浇水,湿度保持在80%左右。

1.2.3 测定项目及方法 产量测定:观察两面针幼苗生长情况并于培养3、6、9和12个月时随机选取不同处理的两面针样品测量其生长指标;每次取样后,用自来水冲洗两面针植株表面残余的土壤,最后用纱布吸干水分,测量其株高、鲜重、根重等生长指标;进行两面针样品烘干时,将其地上和地下部分离,置于60 ℃烘箱中烘干至恒重,记录样品干重。样品烘干后用于分析生物量。

主要活性成分含量测定:分别将培养3、6、9和12个月干燥后的两面针根部粉碎过60目(0.3 mm)筛,采用高效液相色谱法(HPLC)测定其氯化两面针碱和白屈菜红碱含量。

相关分析:对两面针幼苗4个培养时期的各指标进行相关分析,比较活性有效成分含量和生长指标的关联性。

1.3 统计分析

试验数据采用Excel 2003进行整理,以SPSS 23.0进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 内生真菌Y118对两面针幼苗生长指标的影响

2.1.1 菌苗共培养3个月的生长指标 由表1可知,在促生培养满3个月时,真菌Y118处理两面针幼苗的鲜重、株高、茎基宽和茎中宽分别为34.76 g、34.47 cm、6.54 mm和4.25 mm,分别是CK的7.08、3.10、2.40和1.29倍,与CK间均存在极显著差异(P<0.01,下同);根鲜重和茎鲜重分别为8.18和7.53 g,分别是CK的12.39和8.56倍,与CK间存在极显著差异;叶鲜重为16.99 g,是CK的6.34倍,与CK间存在显著差异(P<0.05,下同);根干重、茎干重和叶干重分别为2.08、2.59和5.32 g,分别是CK的12.24、10.79和8.06倍,与CK间存在极显著差异。可见,施用内生真菌Y118可极显著促进两面针幼苗根、茎、叶生长(株型和根系形态见图1)。

A.株型生长形态;B.根生长形态。A.Plant-type growth pattern;B.Root growth pattern.图1 菌苗共培养3个月的两面针幼苗生长形态Fig.1 Growth morphology of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 3 months

表1 菌苗共培养3个月的两面针幼苗生长情况Table 1 Growth of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 3 months

2.1.2 菌苗共培养6个月的生长指标 由表2可知,当培养满6个月时,真菌Y118处理两面针幼苗的鲜重和株高分别为68.33 g和47.85 cm,分别较CK极显著增加53.17%和31.02%;茎中宽为5.10 mm,较CK显著增加12.33%;茎基宽与CK无显著差异(P>0.05,下同);根鲜重、茎鲜重和叶鲜重分别为17.34、14.35和31.83 g,分别较CK极显著增加89.92%、65.51%和45.34%;根干重、茎干重和叶干重分别为4.20、6.39和10.57 g,分别较CK极显著增加51.08%、68.16%和35.51%。

表2 菌苗共培养6个月的幼苗生长情况Table 2 Growth of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 6 months

2.1.3 菌苗共培养9个月的生长指标 由表3可知,当培养满9个月时,真菌Y118处理两面针幼苗的鲜重、株高和茎基宽分别为73.80 g、49.22 cm和9.79 mm,分别较CK极显著增加60.64%、68.04%和20.72%;茎中宽与CK无显著差异;根鲜重和茎鲜重分别为18.54和16.91 g,分别较CK显著增加33.86%和94.82%;叶鲜重为36.26 g,较CK极显著增加73.74%;根干重、茎干重和叶干重分别为5.74、8.33和13.43 g,分别较CK极显著增加56.40%、103.67%和 82.72%。

表3 菌苗共培养9个月的两面针幼苗生长情况Table 3 Growth of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 9 months

2.1.4 菌苗共培养12个月的生长指标 由表4可知,当培养满12个月时,真菌Y118处理两面针幼苗的鲜重为78.71 g,较CK极显著增加54.58%;株高、茎基宽和茎中宽与CK无显著差异;茎鲜重和叶鲜重分别为10.06和39.78 g,分别较CK极显著增加10.31%和77.43%;根鲜重与CK无显著差异;根干重、茎干重和叶干重分别为6.12、8.54和13.56 g,分别较CK极显著增加47.12%、88.94%和73.62%。

表4 菌苗共培养12个月的幼苗生长情况Table 4 Growth of the Z.nitidum vaccine after co-culture for 12 months

综合以上4个培养阶段的分析结果发现,施用内生真菌Y118后尽管在不同培养阶段两面针生长速度不同,但内生真菌Y118均可明显促进其幼苗根、茎和叶的生长。

2.2 两面针根部氯化两面针碱和白屈菜红碱含量测定

从图2可看出,菌苗共培养满3个月和6个月时,真菌Y118处理两面针根部的氯化两面针碱含量与CK相比虽明显增加,但差异不显著;菌苗共培养满9个月时,真菌Y118处理两面针根部的氯化两面针碱含量为0.783 mg/g,较CK显著增加42.11%;菌苗共培养满12个月时,真菌Y118处理两面针根部的氯化两面针碱含量为0.904 mg/g,较CK显著增加44.18%。从图3可看出,菌苗共培养满3个月和6个月时,真菌Y118处理两面针根部的白屈菜红碱含量均高于CK,但无显著差异;菌苗共培养满9个月时,真菌Y118处理两面针根部的白屈菜红碱含量为3.704 mg/g,较CK显著增加40.73%;菌苗共培养满12个月时,真菌Y118处理两面针根部的白屈菜红碱含量为4.201 mg/g,较CK显著增加26.57%。综上所述,施用真菌Y118在一年期内可促进两面针活性成分氯化两面针碱和白屈菜红碱含量积累,提高其药材品质。

图柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同。Different lowercase letters on the bar represented significant difference(P<0.05),the same as below.图2 不同培养阶段两面针根部的氯化两面针碱含量比较Fig.2 Comparison of nitidine chloride content in different culture stages in the root of Z.nitidum

图3 不同培养阶段两面针根部的白屈菜红碱含量比较Fig.3 Comparison of chelidonine content in different culture stages in the root of Z.nitidum

2.3 两面针根部有效活性成分生物碱含量与生长指标的相关分析

对两面针幼苗4个培养时期的各指标进行相关分析,结果(表5)表明,两面针根部有效活性氯化两面针碱含量与各生长指标均呈显著或极显著正相关,相关密切程度排序为培养时间(0.996)>根干重(0.982)>茎基宽(0.960)>叶鲜重(0.959)>茎干重(0.955)>叶干重(0.953);白屈菜红碱含量与根干重呈极显著正相关,与培养时间、茎基宽、茎干重、叶干重、叶鲜重和茎中宽呈显著正相关,相关密切程度排序为根干重(0.995)>培养时间(0.983)>茎基宽(0.981)>茎干重(0.977)>叶干重(0.976)>叶鲜重(0.973)>茎中宽(0.956)。说明通过增加培养时间、根干重、茎基宽、叶鲜重、茎干重和叶干重均可显著或极显著提高两面针根部的氯化两面针碱和白屈菜红碱含量。

表5 两面针根部有效活性生物碱含量与生长指标相关分析Table 5 Correlation analysis between the content of active alkaloids and growth indexes in the root of Z.nitidum

3 讨 论

两面针为亚灌木植物,生长周期长,一般栽培3～5年甚至更长年限才能以根入药[8]。近年来毁林开荒现象逐年严重,两面针野生资源不断减少[18],为了提高两面针药材的综合效益,需通过模拟自然条件探索内生真菌对其生长的促进作用。本研究结果表明,接种内生真菌Y118可促进两面针幼苗茂盛生长,接种后两面针幼苗4个培养阶段(3、6、9和12个月)植株的形态均发生明显变化,其中,生长参数(鲜重、株高、茎宽、根鲜重、茎鲜重、叶鲜重、根干重、茎干重和叶干重)在4个培养阶段均显著增加,在培养3个月时的促生长效果尤其明显,可能是因为在4月施加菌肥时正值广西南宁的春季,温度和光照适宜,是最佳施肥期;而培养6和9个月时分别是广西南宁的10月和次年1月,这2个时期的植株刚好分别经历炎热的夏季和寒冷干旱的秋冬季,故生长缓慢;在培养的第6～9个月时间段,两面针生物量的积累速度比培养第3～6个月时间段减慢,一方面是因为前者由秋入冬,环境的温度、湿度和光照等不利于两面针生长,另一方面是内生真菌Y118固体发酵培养基逐渐代谢,被逐渐消耗,对两面针生长的促进作用降低,同时温度过低不利于菌丝生长,这与陈龙[16]研究获得25 ℃时Y118菌株的菌丝生长快、菌丝质地均匀、色泽鲜亮,温度过低或过高菌丝生长缓慢的结果相符。

氯化两面针碱和白屈菜红碱是两面针根部的主要活性成分,均为衡量两面针药材品质的重要指标[19-20]。其中,氯化两面针碱具有消炎、镇痛、抗菌等功效[21],对抑制癌细胞增殖和诱导癌细胞凋亡具有显著作用[22];白屈菜红碱作为一种天然存在的苯并菲啶类生物碱,在抗菌、消炎、镇痛及抑制寄生虫生存等方面发挥着良好的生物活性作用[23]。本研究利用内生真菌Y118与两面针植株进行共培养,发现Y118菌株通过促生作用明显有利于两面针根部氯化两面针碱和白屈菜红碱活性成分积累,且当培养满9和12个月时,氯化两面针碱和白屈菜红碱含量均较CK显著增加,与任建国等[24]对太子参[Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax)]的研究结论相似。因此认为,对于生长周期较长的两面针,在其人工种植过程中可利用内生真菌Y118进行促生栽培。后续将开展接种内生真菌Y118在相同培养时间内实现两面针高产、提升药材活性成分含量以提高药材品质的大田试验,以及对减少化肥农药使用量影响等研究,为生产上利用内生真菌Y118提高两面针的综合效益提供更确切的依据。

4 结 论

接种内生真菌Y118可显著或极显著提高两面针幼苗的鲜重、株高、茎基宽和茎中宽,有利于促进两面针幼苗生长发育,提高两面针根部主要活性成分氯化两面针碱和白屈菜红碱含量,提升两面针药材的综合效益。