头孢雷特中主要降解产物的结构解析

宋艳霞 胡小爱 陈启立 马晓黎 何钢 李直

收稿日期：2023-03-09

基金项目：天然产物化学与小分子催化四川省高校重点实验室开放课题（TRCWYXFZCH2022B01，TRCWYXFZCH2022B02）；

四川省药物制剂及装备工程技术研究中心开放课题基金（ERCPEF21-04）；

成都大学人才培养质量和教学改革项目（cdjgb2022156）。

作者简介：宋艳霞，助理研究员，主要从事药物分析研究工作。

*通讯作者：李直，助理研究员，主要从事药物分析研究工作。

摘要：目的 对头孢雷特中的主要降解产物进行结构解析。方法 采用液质联用技术对2个主要降解产物进行质谱分析，初步确认结构后通过TLC法、制备液相色谱法、化学合成等方法得到头孢雷特中2个未知降解产物单体，并进一步利用核磁共振（NMR）技术、质谱（MS）等进行结构确证。结果 2个主要降解产物分别为5-巯基-1H-四氮唑乙酸和（6R，7R）-7-[[（邻氨甲基苯）乙酰]氨基]-3-羟甲基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4，2，0]-辛-2-烯-2-甲酸。结论 本研究为头孢雷特工艺生产和贮存条件的选择提供了科学依据。

关键词：头孢雷特；降解产物；结构解析； LC-MS；NMR

中图分类号：R978.1+1         文献标志码：A         文章编号：1001-8751（2023）06-0430-04

Structural Analysis of the Main Degradation Products of Ceforanide

Song Yan-xia1，   Hu Xiao-ai2，   Chen Qi-li3，   Ma Xiao-li1，   He Gang1，   Li Zhi1

（1 Sichuan Industria Institute of Antibiotics，Chengdu University，   Chengdu   610106;

2 Gansu Jingning County Hospital of Traditional Chinese medicine，   Jingning   743400;

3 China Medical University，   Shenyang   110122）

Abstract： Objective To identify the major degradation products of ceforanide. Methods LC-MS was adopted to preliminarily analyze the structure of two major degradation products， two unknown degradation products of ceforanide were obtained by TLC， preparative liquid chromatography and chemical synthesis， and their structures were further identified by NMR and MS. Results The two main degradation products were 5-mercapto-1H- tetarzole acetic acid and （6R，7R）-7-[[（ortho amino methyl benzene） acetyl] amino]-3-hydroxymethyl-8-oxo-5- dithia-1-azabicyclo [4，2，0]-symplectic-2-ene-2-acid. Conclusion This study provides a scientific basis for the production and storage conditions of ceforanide.

Key words： ceforanide;   degradation product;   structure analysis;   liquid chromatography-mass spectrometry; nuclear magnetic resonance

头孢雷特（Ceforanide）是一种非肠道吸收的，由7-ACA经C7-和C3-位结构改造而得到的广谱抗生素，属于第二代头孢菌素类药物，主要用于革兰阴性菌和部分革兰阳性菌所引起的感染治疗。于1984年由美国百时美（Bristol）公司研发成功并上市。头孢雷特的化学结构式如图1所示。为了更好地控制头孢雷特原料药的质量，本文更深入地对头孢雷特的降解杂质进行研究。首先利用快速、简便的高效液相色谱法对头孢雷特强制降解试验中的杂质进行分离，然后利用薄层色谱法（TLC）、制备液相色谱法、化学合成等方法得到头孢雷特中2个未知杂质单体，最后采用核磁共振（NMR）和质谱（MS）等进行结构确认，解析出了未知杂质的结构，为头孢雷特原料的杂质控制提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AD（SHIMADZU）高效液相色谱仪；LC-8A（SHIMADZU）制备液相色谱仪；Spectrum One 红外光谱仪；Agilent1100液质联用仪；Brucker DRX-500MHz型核磁共振仪；MettlerAE163 电子天平。

1.2 药品与试剂

头孢雷特原料（四川抗菌素工业研究所提供，批号：150614）；乙腈为色谱纯；水为去离子水；甲酸铵、甲酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 头孢雷特降解产物液相色谱分离方法

2.1.1 液相色谱条件

采用phenomenex Luna 5 μ C18（2）（ 200×4.60 mm）色谱柱；以0.02 moL/L甲酸铵水溶液（用甲酸调节pH为 2.50）—乙腈（88：12）为流动相；检测波长为254 nm；流速1.0 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为 20 μL。

2.1.2 降解试验的方法与结果

取本品（150614批）约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加1%的碳酸氢钠溶液1.0 mL溶解后，用流动相稀释制成每1 mL中含0.5 mg的溶液，摇匀，作为供试品溶液；取本品约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，分别进行如下降解试验：（1）碱降解：用1%的碳酸氢钠溶液溶解后，加入0.1 moL/L 氢氧化钠溶液0.3 mL，室温降解1 h，用0.1 moL/L盐酸溶液0.3 mL中和；（2）酸降解：用1%的碳酸氢钠溶液溶解后，加入0.1 moL/L盐酸溶液0.3 mL，室温降解1 h，用0.1 moL/L 氢氧化钠溶液中和；（3）热降解：在120℃降解2 h后，用1%的碳酸氢钠溶液溶解；（4）氧化降解：加1%的碳酸氢钠溶液1.0 mL溶解后，再加入30%的双氧水0.1 mL，室温放置30 min；（5）光降解：在照度为4500LX的强光下照射5 d，加1%的碳酸氢钠溶液1.0 mL溶解；（6）未降解：用1%的碳酸氢钠溶液1.0 mL溶解。将上述各样品分别加流动相稀释成每1 mL含0.5 mg的供试液。取以上降解试验样品溶液及未降解样品溶液，按上述液相色谱条件对头孢雷特进行色谱分析，得碱、酸、热、氧化、光照降解溶液色谱图及未降解溶液色谱图，图2为未降解溶液色谱图，图3为重叠色谱图。

试验结果表明，扣除溶剂峰后，头孢雷特的主要降解产物有2个，按液相色谱相对保留时间（RT）先后顺序将降解产物命名为杂质Ⅰ（2.9 min，RT=0.42～0.52）、杂质Ⅱ（4.3 min，RT=0.60～0.66）。头孢雷特对光较稳定，对碱、酸、热、氧化不稳定。在碱、酸、热条件下，RT为0.42～0.52（杂质Ⅰ）及0.60～0.66（杂质Ⅱ）的杂质显著增加，RT为0.91及1.20的杂质略有增加；在氧化条件下RT为0.60～0.66（杂质Ⅱ）的杂质稍有增加。

2.2 液质联用分析

2.2.1 色谱条件

采用色谱柱Agilent ZOBAX SB-C18（250 mm× 4.6 mm，5 μm） ；以水（用甲酸调节pH2.5）—乙腈（88：12）为流动相；检测波长为254 nm；流速为1.0 mL/min；柱温为35 ℃；进样量为 20 μL。

2.2.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI），扫描方式为正负离子扫描，扫描范围m/z70-1000，毛细管电压为4.5 KV，干燥气流速6.0 L/min，干燥气温度为220 ℃。

2.2.3 结果解析

取高温降解样品溶液利用上述条件对杂质Ⅰ和杂质Ⅱ进行液质联用分析，测得杂质Ⅰm/z为158.9，推测为5-巯基-1H-四氮唑乙酸；测得杂质Ⅱm/z为378.0，推测为（6R，7R）-7-[[（邻氨甲基苯）乙酰]氨基]- 3-羟甲基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4，2，0]-辛-2-烯-2-甲酸。杂质Ⅱ液质联用的HPLC色谱图见图4，质谱图见图5。

2.3 杂质的制备及结构解析

2.3.1 杂质Ⅰ的制备及NMR、MS分析

将头孢雷特样品置高温条件下加热15 min后，用1%碳酸氢钠溶液溶解稀释，将溶液点样于制备用薄层板上，阴凉处挥干后，置层析缸中展开，展开剂为二氯甲烷：甲醇：冰乙酸=75：25：0.5，于254 nm紫外灯下显色，刮板将所需色带的硅胶粉研细，用甲醇洗脱，洗脱液于低温旋干即得杂质Ⅰ样品。将得到的杂质Ⅰ样品分别进行了NMR和MS分析，得到如下结果。

（1）NMR分析：将杂质Ⅰ用二甲基亚砜（DMSO）溶解，加入少量四甲基硅（TMS）作内标，在25℃条件下，采用600MHz核磁共振波谱仪进行核磁共振测试。杂质Ⅰ的δ1H-NMR（500Hz，DMSO）[1-2]：5.13（1H，s，7-COOH），4.16（1H，dd，5-SH），1.18（2H，t，6-CH2），δ13C-NMR（500Hz，DMSO）：167.2（C-7），165.0（C-5），47.4（C-6）。氢谱数据共计4个氢原子，与5-巯基四氮唑乙酸分子式C3H4N4O2S中4个氢原子相符。13C-NMR数据表明共计3个碳原子，亚甲基（-CH2-）1个，季碳原子共2个，与5-巯基-1H-四氮唑乙酸结构中1个亚甲基、2个季碳原子相符合。

（2）MS分析：质谱数据测得杂质Ⅰ的分子离子峰[M-1]+为159.0，与5-巯基-1H-四氮唑乙酸分子量m=160.0相符合。结合杂质Ⅰ1 H-NMR谱、13C-NMR谱和MS谱各项下的数据分析可知，所制备的杂质Ⅰ应为5-巯基-1H-四氮唑乙酸，结构如图6所示。

2.3.2 杂质Ⅱ的制备及NMR、MS分析

三颈瓶中加入头孢菌素（7-ACA） 5 g，二氯甲烷50 mL，乙酸铵10 mL，浓硫酸1滴，在45 ℃加热回流30 min，至瓶内溶液全部透明。停止加热，用冰冷却，得溶液A。在另一三颈瓶中加入2-氨甲基苯乙酸邓盐11.0 g、二甲基甲酰胺90 mL、吡啶1.8 mL，冰浴。向三颈瓶中滴加次氯酸叔丁酯6.0 mL和二氯甲烷45 mL，再滴加三乙胺4 mL和二氯甲烷10 mL，最后滴加溶液A，在冰浴中搅拌过夜后，自然升温至室温，加入6%碳酸氢钠溶液适量，加水50 mL，静置分层，取上清液，调节pH至2.3，溶液呈浑浊状，过滤后母液有固体析出，得固体A共1.6 g。在100 mL三颈瓶中，加入1 g固体A，冰浴冷却至5 ℃，加入少量碳酸氢钠、甲醇、水溶解，滴入少量20%NaOH至溶液澄清，采用制备液相色谱法分离制备得杂质Ⅱ，约100 mg，将得到的杂质Ⅱ样品分别进行了NMR和MS分析，得到如下结果。

（1）NMR分析：杂质Ⅱ的1H-NMR[500MHz，DMSO，δ（ppm），J（Hz）][3-5]：3.76（s，2H，7γ-CH2-），3.78（s，2H，4-CH2-），4.12（t，2H，2'-CH2-），4.51（s，1H，3α-OH）5.02（d，J=18.4Hz，2H，3α-CH2-），5.06（d，J=5.1Hz，1H，6-CH-）， 5.77（dd， J=8.2，5.0Hz，1H，7-CH-），7.30（m，3H，6'、7'、8'-CH-），7.47（d，1H，5'-CH-），8.47（s，3H，1'-NH2、7α-NH-），9.55（d，J=8.2Hz，1H， 2α-OH）；13C-NMR[500MHz， DMSO，δ（ppm）]：171.58 （C-7β），166.40 （C-8），163.51 （C-2α），142.57（C-3'），134.81 （C-2），132.77 （C-4'），130.50-127.38（C-5'， C-6'、C-7'、C-8'），120.40（C-3），71.29 （C-3α），59.52 （C-7），56.91 （C-6），39.82 （C-2'），38.69 （C-7γ），22.49 （C-4）。氢谱数据显示共计19个氢原子，与杂质Ⅱ分子式C17H19N3O5S中19个氢原子相符。13C-NMR数据表明共计16个碳原子，其中6'和7'位C的化学环境相同而重叠，故显示为16组碳原子信号。结合杂质Ⅱ的DEPT（135°）谱解析：甲基与次甲基（-CH-、-CH3）共计5组（6个），亚甲基（-CH2-）4个，剩余的季碳共7个，与杂质Ⅱ结构符合。

（2）MS分析：质谱数据测得杂质Ⅱ的分子离子峰[M]+为377.8，与7-氨甲基苯乙酸-3-羟基头孢烷酸分子量m=377.10相符合，与液-质联用所测得杂质Ⅱ的m/z=378.0相符。结合杂质Ⅱ1H-NMR谱、13C-NMR谱和MS谱各单项下的数据分析可知，所制备的杂质Ⅱ应为（6R，7R）-7-[[（邻氨甲基苯）乙酰]氨基] – 3-羟甲基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4，2，0] -辛-2-烯-2-甲酸，结构如图7所示，氢谱见图8，碳谱见图9。

3 结论

杂质Ⅰ的结构确证中，杂质Ⅰ的质谱分别作正离子和负离子检测，正离子检测时，在分子区产生大量碎片离子峰，负离子检测时仅有159.0和116.0离子峰。根据巯基四氮唑结构，分子中易失去H+产生分子离子峰。因此对于杂质Ⅰ采用负离子方式进行检测。

综上所述，本文制备了头孢雷特原料降解过程中产生的主要杂质Ⅰ和杂质Ⅱ的结构，并利用核磁共振技术、质谱等进行了结构确证，为头孢雷特的质量控制提供了科学依据。建议该产品在储存和运输过程中尽量避开酸、碱、高温环境，以此来保证头孢雷特的产品质量。

参 考 文 献

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