化妆品中抗生素的分析检测方法研究进展

吕广云 朱琳 孙晓娟

收稿日期：2022-12-29

作者简介：吕广云，硕士，主要从事药品和化妆品质量监督研究工作。

*通讯作者：孙晓娟，硕士，主要从事药品和化妆品质量监督研究工作。

摘要：抗生素常被非法添加至功能性化妆品中，不仅对消费者的身体健康和利益造成严重影响，也扰乱了化妆品市场的良好秩序。通过查阅相关文献，本文按检测的抗生素类别，对近年来非法添加的抗生素的前处理技术以及检测方法进行了综述，为化妆品中抗生素的检验检测工作提供参考。

关键词：抗生素；化妆品；前处理技术；检测方法；非法添加

中图分类号：R978.1         文献标志码：A         文章编号：1001-8751（2023）06-0383-07

Progress in the Analysis and Detection of Antibiotics in Cosmetics

Lyu Guang-yun，   Zhu Lin，   Sun Xiao-juan

（Nantong Food and Drug Control Center，   Nantong   226006）

Abstract： Antibiotics are often illegally added to functional cosmetics. This kind of cosmetics can not only cause serious damage to the interests and health of consumers but also disrupt the normal market order. This study offers a theoretical reference on antibiotics in cosmetics and， through a review of pertinent literature， highlights the pretreatment methods and detection strategies for antibiotics found in cosmetics in recent years according to the types of antibiotics.

Key words： antibiotic;   cosmetic;   pretreatment technique;   detection method;   illegally adding

化妆品种类繁多，使用目的多样，应用范围广，备受消费者青睐。然而近年来化妆品行业繁荣兴盛的同时也带来了层见叠出的质量以及安全问题，重点分为三类：一是非法添加禁用物质；二是限用物质超量；三是微生物污染或者超标。其中第一类的问题更为严峻，尤其是添加抗生素成分。由于抗生素具有杀菌和抑菌的作用，常被不法生产商非法添加至祛痘、除螨以及抗粉刺的功能性化妆品中，细菌长期暴露在这样的环境中会产生耐药性并有可能传播抗性基因，从而对环境及人类健康造成不良影响。本文按抗生素的类别综述了近年来化妆品中抗生素的前处理技术以及检测方法，旨在为化妆品的检测研究提供参考。

1 抗生素概述

抗生素是指由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的或人工合成的具有抗病原体或其他活性的一类物质。抗生素的种类很多，按化学结构可分为β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、氨基糖苷类、喹诺酮类、磺胺类及其他类（如硝基咪唑类、硝基呋喃类、林可霉素类、氯霉素类）等。

根据我国《化妆品安全技术规范》（2022年版）的规定，化妆品中的主要抗生素检测对象是喹诺酮类、四环素类、磺胺类及其他类禁用成分。因此，研究化妆品中抗生素的分析检测方法，对更好地实施质量安全监督以及保障人民群众身体健康具有十分重要的意义。目前，化妆品中抗生素的检测的前处理以超声萃取方法[1-3]为主，检测方法有高效液相色谱法（HPLC）[4-8]、高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）[9-11]、超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）[12-13]、酶联免疫吸附测定法（ELISA）[14-15]和表面增强拉曼光谱法[16]等。

2 抗生素的类别

2.1 喹诺酮类

喹诺酮类抗生素是指人工合成的具有1，4-二氢-4-氧代喹啉-3-羧酸结构的化合物。这类药物通过抑制细菌DNA螺旋酶干扰细菌DNA的合成，导致细胞的死亡，从而起到抗菌作用。喹诺酮类抗生素对铜绿假单胞菌、厌氧菌、淋球菌、衣原体、支原体等病原微生物均有抑菌作用。

Liu等[17]建立了化妆品13种喹诺酮类抗生素的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，样品经固相萃取（SPE）纯化后用UPLC-MS/MS分析检测，采用C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，流动相为0.1%甲酸水溶液和甲醇，梯度洗脱，待测物的检出限可达0.03～3.02 μg/kg。牛增元等[18]采用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-LTQ/Orbitrap-MS）以水剂、乳膏和油剂样品作为研究对象，综合考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲醇-水（1：1，V/V）、乙腈-水（1：1，V/V）、丙酮等提取溶剂对3种类型化妆品中禁用化合物的提取效率。结果表明，甲醇的提取效率最高，如果样品属于“油包水”类型，为破乳需要添加适量的四氢呋喃，以提高目标化合物的回收率。陈静等[19]建立可同时测定化妆品中氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、双氟沙星、沙拉沙星、恶喹酸和氟甲喹等19种喹诺酮类抗生素的超高效液相分析方法，样品采用2%甲酸-乙腈溶液振摇提取，色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH Shield RP C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为甲醇-乙腈（85：15，V/V）和0.05 mol/L磷酸溶液（以三乙胺调至pH 3.6），梯度洗脱，方法检出限为1.2～14.7 mg/kg。表1总结了近年来关于化妆品中喹诺酮类抗生素检测的文献报道。

目前，文献报道的化妆品中喹诺酮类抗生素的检测前处理方法常用甲醇或乙腈超声提取，操作简便，检测方法多为HPLC法和LC-MS/MS法，近期有研究开始采用化学发光酶联免疫检测技术（CL-ELISA）[20]检测化妆品中氟喹诺酮类抗生素，样品采用超声辅助磷酸盐缓冲液（PBS）提取，一方面反应过程无需加入酶标二抗的反应步骤，节省了反应时间；另一方面，采用化学发光底物进行检测，提高反应的灵敏度。该法快速、灵敏、重复性好，可用于化妆品中氟喹诺酮类抗生素的快速筛查研究，但抗原抗体制备困难且种类少，以及对检测环境和操作细节的要求较高，限制了其应用的广泛性。

2.2 四环素类

四环素类抗生素为并四苯衍生物属广谱抗生素，高浓度时对某些细菌呈杀菌作用，对立克次体、衣原体、支原体、螺旋体及某些原虫等均有抑制活性。

赵晓亚等[27]建立了化妆品中四环素、土霉素、金霉素、多西环素、甲烯土霉素、去甲基金霉素、二甲胺四环素、脱水四环素和差相四环素含量的液相色谱串联质谱测定方法。采用乙腈-甲醇-草酸水溶液提取，LC-MS/MS分离测定，色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18液相色谱柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm），预柱为Phenomenex C18（3.0 mm×4.0 mm），流动相为水、甲醇、0.5％甲酸溶液和乙腈，梯度洗脱，样品中被测物之间及被测物与干扰物之间均实现有效分离。张燕惠等[28]建立化妆品中10个四环素类抗生素的高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品经甲醇+0.1 mol/L甲酸溶液（1+1，V/V）涡旋超声提取后，经Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×75 mm，3.5 μm）分离，以0.2%甲酸水溶液和0.2%甲酸的甲醇溶液为流动相，梯度洗脱，检出限小于0.04 μg/g，平均回收率为76.8%～96.9%。关于化妆品中四环素类抗生素检测的近期文献总结如表2所示。

随着HPLC-MS/MS技术的成熟，研究者越来越多地采用超高效液相色谱-线性离子阱静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-LTQ/Orbitrap-MS）进行化妆品中非法添加抗生素的筛查数据库的建立和应用。李红英等[3]选取乳液类化妆品作为典型代表基质，分别考察了乙腈、乙腈-2%（v/v）甲酸水溶液（3：2，V/V）、甲醇等提取溶剂对乳液类化妆品中化合物的提取情况，运用超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-LTQ/Orbitrap-MS），同时测定了化妆品中66种抗生素化合物，建立了筛查数据库，无需对照品即可完成66种抗生素化合物的快速筛查和确证，大大提高了日常检验的工作效率和化妆品安全风险监控水平，对日常监管检验工作具有非常重要的意义。

目前，文献报道的化妆品中四环素类抗生素的检测前处理方法常用甲醇或乙腈超声提取，操作简便且提取率高，检测方法多为HPLC法和LC-MS/MS法，HPLC法能达到的最低检测限为0.06 μg/g，LC-MS/MS法能达到的最低检测限为0.002 μg/g，相较于HPLC法，LC-MS/MS法具有更高的检测灵敏度和更低的检出限，在非法添加量较小时也能较为准确的定量。

2.3 磺胺类

磺胺类抗生素是1932年发现的人工合成的一类具有对氨基苯磺酰胺结构的化合物。这类药物抗菌谱广，对多种球菌如溶血性链球菌、肺炎链球菌、葡萄球菌属及某些杆菌如大肠埃希菌、奇异变形杆菌等都有抑制作用，可用于治疗脊髓膜炎、流行性脑炎、泌尿道、上呼吸道、肠道及其他细菌性感染。

钱叶飞等[34]建立了HPLC-DAD同时检测化妆品中非法添加21种磺胺类抗生素的方法，样品采用2%甲醇提取，色谱柱为Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），以甲醇和0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，方法检出限为0.09～0.36 μg/mL。马强等[35]分别考察了不同的提取溶剂（甲醇、乙腈、四氢呋喃、水、50％ 甲醇水溶液、20％四氢呋喃水溶液）和提取时间（10、15、20、25和30 min）等条件下的提取效果，确定了不同样品类型的提取方法。甲醇-水（5＋5，V/V）可作为膏霜、水剂、散粉和香波类化妆品的提取液；而含有较多的油脂和蜡类等成分的唇膏类样品，先加入四氢呋喃溶解样品基质，再进行超声提取。22种磺胺类药物的方法检出限为3.5～14.1 μg/kg；在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为80.3％～103.6％。表3总结了近年来关于化妆品中磺胺类抗生素检测的文献报道。

目前，文献报道的化妆品中磺胺类抗生素的检测前处理方法常用甲醇或乙腈超声提取，操作简便且提取率高，如果样品基质较为复杂，可以添加适量的四氢呋喃进行破乳或采用冷冻的方式进行水油分离， 以提高目标化合物的回收率。磺胺类抗生素的检测方法多为LC-MS/MS法，能达到的最低检测限为0.002 μg/g，LC-MS/MS法因同时具有色谱仪和质谱仪的优点，逐渐成为磺胺类抗生素检测的主流技术。

2.4 其他类

其他类包括氯霉素类、硝基咪唑类、硝基呋喃类和林可霉素类等也是临床常见的抗生素。以文献中报道较多的氯霉素类和硝基咪唑类为例重点总结。氯霉素类为广谱抗生素，对革兰阴性及阳性细菌都有抑制作用。临床上主要用于治疗伤寒、副伤寒、斑疹伤寒等。硝基咪唑类药物的发现经历了四代，从第一代的甲硝唑，经过第二代替硝唑，第三代奥硝唑，到现在的第四代塞克硝唑。

孟宪双[37]等建立了祛痘化妆品中氯霉素、甲砜霉素及氟苯尼考3种氯霉素类抗生素的高效液相色谱-串联质谱检测方法。样品以甲醇为溶剂超声提取，色谱柱为XBridge Phenyl（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），流动相为乙腈和水，梯度洗脱，以电喷雾负离子多反应监测模式进行定性及定量分析，检出限为2.5～10 μg/kg。Meng等[38]采用HPLC/MS/MS法同时检测化妆品中15种硝基咪唑类抗生素的方法，乳液、霜剂、香波类样品采用25%甲醇水溶液提取，固体样品采用50%甲醇水溶液提取，色谱柱为Waters XSelect CSH C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm），以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，方法定量限为0.01～0.1 mg/kg。关于化妆品中其他类抗生素检测的近期文献总结如表4所示。

关于化妆品中其他类抗生素的检测文献报道，检测方法多为仪器分析法，如HPLC法[6-8]、HPLC-MS/MS[28，30]和超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）[12-13]。化学分析法相比较于仪器分析法灵敏度较低，易受基体干扰，但检验成本低，且反应速度快，因此可应用于抗生素中非法添加抗生素的快速初步筛查。简淑娟等[39]利用林可霉素类抗菌药物分子结构中甲硫基在酸性条件下易被氧化发生氧化还原反应而显色的特性，建立快速筛查化妆品中非法添加林可霉素类抗菌药物的方法。该实验中113批样品中可能添加克林霉素或林可霉素40批，假阳性6批，真阴性67批，达到快筛方法的技术指标，可作为化妆品中非法添加林可霉素类抗菌药物样品的快速初筛方法。

3 总结

本文综述的化妆品中抗生素的分析检测文献，分析对象大部分是喹诺酮类、四环素类、磺胺类及硝基咪唑类。目前常用的前处理方法主要有超声波提取法[1-3]和固相萃取法[13，17]。由于化妆品基质的复杂性，当一种前处理方式无法满足分析需要时，需要针对不同的基质采用不同的前处理方式[18，21，35]。

前期的分析方法多为HPLC法[4-8]，但由于化妆品种类多且基体复杂，易存在基质干扰，呈现假阳性结果。近年来，LC-MS/MS由于灵敏度高、特异性好、响应速度快，可以实现对复杂基体中多种目标物的同时快速测定，已被广泛应用于化妆品中抗生素的分析测定[2-3，12，30]。但LC-MS/MS适用于已知目标物的分析，在没有标准物质的情况下，很难快速完成检测。值得一提的是，兼具离子阱和高分辨质谱平行检测能力的超高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱高分辨质谱法（UPLC-LTQ/Orbitrap-MS）已在化妆品中非法添加抗生素领域得到应用[2-3，18]，无需使用标准物质、运用已有的数据库就能实现可以快速、准确地筛查、确证化妆品中的抗生素类禁用物质，很大程度提高了日常监督检验的工作效率，但目前涉及的化合物种类较少，需进一步扩大检测范围，建立更大容量的数据库。

抗生素具有抗菌和抑菌的作用，因而其合理的使用和有效的管理一直是研究的热点和重点[44-45]。化妆品的功能多样化，组分繁多，化妆品的安全性备受关注，这对化妆品质量安全的监督检验提出了更高的要求。开发快速、高效、高通量、高选择性、高准确度和高灵敏度的检测技术以适应当前化妆品质量安全检验工作要求显得尤为重要。同时，应该加快化妆品相应分析检测方法标准的制订，完善各种监管制度，切实加强对化妆品行业的质量监管，确保政府的有效监管和企业自律有机结合起来，为化妆品市场的健康发展以及人民的安全健康做出贡献。

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