黄芩提取物对脓肿分枝杆菌生长及生物膜形成的影响

东宝瑜 许馨月 李树华 李帅 曾雪婷 王雨萌 孙琨 汪川 曾菊梅

摘 要    ：为了研究黄芩提取物对脓肿分枝杆菌浮游细菌及生物膜的影响，本研究以脓肿分枝杆菌标准菌株ATCC 19977以及临床分离株作为受试菌，采用Alarmar-Blue液体药敏法测定黄芩提取物对脓肿分枝杆菌的最小抑菌浓度（MIC），平板涂布法测定最小杀菌浓度（MBC），结晶紫染色法和扫描电子显微镜分析黄芩提取物对脓肿分枝杆菌生物膜形成量及形态结构的影响，进一步采用了RT-qPCR探究黄芩提取物对分枝菌酸合成相关基因表达的影响.结果表明黄芩提取物对脓肿分枝杆菌标准菌株ATCC 19977以及8株临床分离株的MIC  90为50～100 mg/mL，MBC为50～200 mg/mL；黄芩提取物可显著降低脓肿分枝杆菌生物膜形成量（ P <0.05），破坏生物膜的结构，并且显著降低分枝菌酸合成相关基因表达量（ P <0.01）.本研究表明黄芩提取物能够抑制脓肿分枝杆菌的生长以及生物膜的形成.

关键词 ： 黄芩提取物； 脓肿分枝杆菌； 浮游生长； 生物膜抑制

中图分类号 ： Q93 文献标识码 ： DOI ：  10.19907/j.0490-6756.2023.046003

收稿日期：  2022-09-21

基金项目：   四川省国合项目（2022YFH0048）； 四川大学中央高校基本科研业务费（YJ201985）； 口腔疾病研究国家重点实验室开放课题（SKLOD2022KXK0403）； 四川大学大学生创新创业训练计划（C202210610203）

作者简介：   东宝瑜（1997-）， 女， 甘肃天祝人， 硕士研究生， 研究方向为公共卫生. E-mail： 1226046785@qq.com

通讯作者：  曾菊梅.E-mail： zengjumei@scu.edu.cn

Effect of  Scutellaria baicalensis  extract on the growth and  biofilm formation of  Mycobacterium abscessus

DONG Bao-Yu  1， XU Xin-Yue  1， LI Shu-Hua  1， LI Shuai  2， ZENG Xue-Ting  3，  WANG Yu-Meng  1， SUN Kun  1， WANG Chuan   1， ZENG Ju-Mei   1

（1. Research Center for Poisoning Treatment， Laboratory Science ＆ Precision Prevention， West China-PUMC C.C. Chen  Institute of Health， West China School of Public Health and West China Fourth Hospital， Sichuan University，  Chengdu 610041， China; 2.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences， Chengdu 610041， China;

3.Department of Medicament， Army Characteristic Medical Center， Army Medical University， Chongqing 400042， China）

To study the effect of  Scutellaria baicalensis  extract on  Mycobacterium abscessus ， the standard strain of  M. abscessus  ATCC 19977 and clinical isolates were used as the test bacteria. The minimum inhibitory concentration （MIC） of  S. baicalensis  extract against  M. abscessus  was determined by the Alarmar-Blue method; the minimum bactericidal concentration （MBC） was determined by plate coating method; crystal violet staining method and scanning electron microscope assay were used to analyze the effect of  S. baicalensis  extract on the biomass formation and morphological structure of  M. abscessus ; RT-qPCR was further used to investigate the effect of  S. baicalensis  extract on the gene expression which involves in mycolic acid synthesis. The inhibitory effects of  S. baicalensis  extract against  M. abscessus  standard strain ATCC 19977 and 8 clinical isolates were evaluated， the results showed that the MIC  90 was 50～100 mg/mL， and the MBC was 50～200 mg/mL. The biofilm formation of  M. abscessus  was significantly decreased after adding  S. baicalensis  extract（ P <0.05）， and  S. baicalensis  extract disrupted the biofilm formation. The expression of genes related to mycolic acid synthesis was significantly decreased in the  S. baicalensis  extract treatment group （ P< 0.01）.  S. baicalensis  extract inhibits planktonic  M. abscessus  growth; meanwhile， it reduces the bacterial adhesion and aggregation on  M. abscessus  biofilm formation.

S. baicalensis  extract;  M. abscessus ; Planktonic   growth; Biofilm inhibition

1 引 言

脓肿分枝杆菌（ Mycobacterium abscessus， M. ab ）是一种常见的致病性非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria， NTM），属于快速生长型分枝杆菌，通常引起炎症性肺部感染（如囊性纤维化）以及严重的皮肤、关节、软组织、手术部位和播散性感染  ［1，2］.抗生素治疗是当前首选的治疗方案，然而，该细菌自身的外膜脂质屏障低渗透性、药物的修饰灭活酶、外排泵系统及靶点突变等因素，使得该菌对大部分临床使用抗生素及利福平和异烟肼在内的抗结核药物耐药  ［3］.此外，脓肿分枝杆菌是一种可形成生物膜的耐多药细菌.生物膜（biofilm）是微生物被包裹在其自身分泌的多聚物中形成的一种特殊细胞群体结构.与浮游细菌相比，脓肿分枝杆菌生物膜对抗生素治疗的耐受性更高  ［4］，临床上许多顽固、难以治疗的感染与生物膜的形成相关.因此，控制生物膜形成是治疗脓肿分枝杆菌感染的新策略  ［5］.

分枝菌酸是分枝杆菌细胞壁上脂质复合物的重要组成部分.值得注意的是，分枝杆菌生物膜的细胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances， EPS）富含分枝菌酸，分枝菌酸可使膜内细菌具有群落内聚力，其合成与生物膜的形成密切相关  ［6］.通过影响分枝菌酸的合成有望抑制脓肿分枝杆菌生物膜的形成.

我国有丰富的中药资源，中药在治疗传染病方面有广泛的前景.黄芩始载于《神农本草经》，别名山茶根、土金茶根，为唇形科植物黄芩  Scutellaria baicalensis Georgi  的干燥根，味苦，性寒，归肺、胆、脾、小肠、大肠经，其有效成分是黄酮类化合物，主要包括黄芩苷（baicalin）、黄芩素（baicalein）等.随着近年来临床治疗的不断深入，研究表明黄芩及 其活性成分具有抗菌、抗病毒 、抗肿瘤、护肝以及免疫保护等作用  ［7］，尤其以抗菌作用最为显著，目前已被证明对包括葡萄球菌属  ［8］、大肠埃希菌  ［9］、幽门螺杆菌  ［10］以及铜绿假单胞菌  ［11］等在内的多种微生物及生物膜有效.

本文旨在探讨黄芩对脓肿分枝杆菌的抑菌作用以及黄芩对脓肿分枝杆菌生物膜形成的抑制作用，为临床有效治疗脓肿分枝杆菌引起的疾病提供理论基础.

2 材料与方法

2.1 材 料

脓肿分枝杆菌标准菌株（ATCC 19977）购自美国模式培养物集存库；脓肿分 枝杆菌临床分离株8株（MAB-S1、MAB-S2、MAB-S3、MAB-S4、MAB-R1、  MAB-R2、MAB-R3、MAB-R4）由四川大学华西第四医院微生物室提供.

2.2 实验方法

2.2.1 菌液准备  用接种环挑取复苏后的单个菌落至无菌7H9液体培养基中，37 ℃培养，用7H9液体培养基作为空白对照管，酶标仪测得菌液OD  600 nm为0.5时，即细菌培养至对数生长期，获得纯菌液备用.

2.2.2 药物准备  黄芩提取物溶解于无菌水，配制为200 mg/mL的储存浓度，通过0.22 μm的滤膜过滤除菌，置于4 ℃冰箱备用.

2.2.3 药物的最小抑菌浓度  采用Alarmar-Blue液体药敏法测定黄芩提取物的MIC.设置卡那霉素作为抑菌对照，不加药物的纯菌液作为生长对照.以二倍稀释设置药物浓度梯度，药物浓度从200 mg/mL到0.39 mg/mL，共设置10个浓度  ［12，13］.每个浓度设置复孔.将接种后的微孔板置于5% CO  2培养箱37 ℃培养48 h，加入Alarmar-Blue指示剂培养过夜.采用多功能微孔板分析仪测定540/595 nm处的荧光值，计算不同药物浓度下对细菌的生长抑制率.MIC  90定义为抑制率大于等于90%对应的最低药物浓度，MIC  50定义为抑制率大于等于50%对应的最低药物浓度.药物作用的抑制率计算公式如下：

抑制率= 1- 试验孔荧光值-抑菌对照荧光值 生长对照荧光值-抑菌对照荧光值  ×  100%

2.2.4 药物的最低杀菌浓度  MBC定义为杀死99.9%（与生长对照孔菌落数比较）的微生物所需的最低药物浓度.药敏试验培养后的微孔板，取药物MIC  90孔及以上两孔、生长对照中的菌液各50 μL作10倍稀释，稀释度依次为10  -1、10  -2、10  -3、10  -4、10  -5  ［14］.将稀释液均匀涂布至7H9固体培养基上，平板倒置培养于5% CO  2培养箱，37 ℃培养3～4 d后，进行菌落计数，三次生物学重复后，将所获得的菌落数做统计分析.

2.2.5 生物膜培养及其抑制  细菌在7H9液体培养基中培养至对数生长期后，收集菌体.用苏通培养基洗涤菌体2次并重悬（OD  600 nm=0.9～1.2），然后用苏通培养基按照1∶100的比例稀释到24孔板中，每孔2 mL.每板在孵育前用Parafilm密封膜覆盖，以减少水份蒸发并允许空气自由交换， 37 ℃ 下孵育 5～7 d，生物膜培养成熟.黄芩提取物的干预，即用苏通培养基稀释的1∶100菌液加入24孔板，每孔中加入黄芩提取物，设置终浓度为0×MIC、0.5×MIC、1×MIC，每孔总体积为2 mL，设置三个平行孔，在第7天收集生物膜.

2.2.6 生物膜的定量分析  通过结晶紫染色确定黄芩提取物对于脓肿分枝杆菌生物膜形成的影响.在24孔板中获得成熟的生物膜后，吸出孔板内的上清液，PBS洗涤，去除浮游细菌.每孔加入1 mL 4%（w/v）多聚甲醛室温固定生物膜15 min，吸弃多聚甲醛，37 ℃烘干孔板，每孔加入1 mL 0.01%（w/v）结晶紫染液，室温静置染色5 min，无菌PBS轻轻洗涤2次去除多余染料；每孔加入2 mL 33%（v/v）乙酸，温和震荡30 min溶解染料；最后，将100 μL乙酸洗脱液转移至一个新的96孔板上，酶标仪575 nm处读取OD值来量化生物膜的形成.

2.2.7 生物膜微观形态分析  使用扫描电子显微镜对黄芩提取物干预生物膜的形态进行观察.将无菌圆形玻片置于24孔板中，分组加样同2.2.5部分，获得成熟的生物膜.去除多余培养基，用PBS轻柔漂洗2～3次去除松散的浮游细菌；将各孔加入2.5%（v/v）戊二醛，4 ℃固定12 h；吸弃戊二醛后PBS轻柔漂洗2次；依次用30％、50％、70％、80%、90%和100%（v/v）的乙醇洗脱，使生物膜梯度脱水；将脱水后样本放入100%（v/v）乙酸正戊酯置换处理，在CO  2临界点干燥仪中干燥，喷金后，用扫描电子显微镜观察生物膜样本的形态结构.

2.2.8 分枝菌酸合成相关基因表达量的测定

① RNA的提取 取2.2.1培养至对数生长期的菌液稀释至OD  600 nm=0.005，设置生长对照组及黄芩提取物处理组（终浓度为25 mg/mL），37 ℃ 下孵育 24 h.收集菌体于无酶离心管中，采用TRIzol法提取细菌总RNA  15］，RNA提取完成后使用Nanodrop 2000分光光度计测定RNA浓度以及OD  260 nm/OD  280 nm.

② cDNA的合成  采用Goldenstar  RT6 cDNA Synthesis Kit Ver.2试剂盒，配制如下反应体系：RNA模板20 ng，gDNA Remover 1 μL，10×gDNA Remover Buffer 1μL，RNase-free Water加至终体积10 μL.混匀体系短暂离心，42 ℃ 2 min，60 ℃ 5 min后，迅速置于冰上冷却，短暂离心后加入以下组分：5×Goldenstar   Reaction Buffer  4 μL，Goldenstar   RT6 （200 U/L） 1 μL， Randomer （50 μmol/L） 1 μL，dNTP Mix （10 mmol/L） 1 μL，DTT 1 μL，RNase-free Water 2 μL.25 ℃  10 min，55 ℃ 15 min，85 ℃ 5 min后终止反应， -80 ℃保存.

③ 基因表达定量分析  配制反应体系：10 μL的2×T5 Fast qPCR Mix （SYBR Green Ⅰ），10 μmol/L上下游引物各0.8 μL，1 μL的cDNA模板，50×ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，RNase-free Water补至20 μL，用 QuantStudio 3仪器进行qPCR，反应程序为 95 ℃ 1 min， 95 ℃ 10 s， 60 ℃ 10～15 s， 40 cycles.设置16S rRNA基因为内参基因，采用2  -ΔΔCt计算方法计算分枝菌酸合成相关基因的相对表达量  ［16］.

2.2.9 统计学处理  正态分布资料数据以  x ±s 表示，采用 SPSS 18.0 软件进行统计学分析，组间差异采用student t检验比较，三组及以上采用单因素方差分析比较组间差异， 然后进行Dunnetts检验.检验水准α=0.05，当 P <0.05时，差异具有统计学意义.采用 GraphPad Prism 8.0软件构建图表.

3 结 果

3.1 最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）

Alarmar-Blue液体药敏法测定黄芩提取物的 MIC结果显示，黄芩提取物对脓肿分枝杆菌标准株的MIC  50为3.13 mg/mL，MIC  90为50 mg/mL（结果见图1）.平板涂布法结果显示黄芩提取物对脓肿分枝杆菌标准株的MBC为100 mg/L.黄芩提取物对脓肿分枝杆菌临床株的MIC  50、MIC  90以及MBC结果如表2所示.

3.2 生物膜定量分析结果

生物膜内的细菌和胞外聚合物可以与结晶紫结合，通过测量吸光度的变化来定量检验药物处理对生物膜的影响.黄芩提取物干预处理后，脓肿分枝杆菌标准株无药对照孔在气液交界面形成一层成熟生物膜，呈乳白色蜡质状，而25、50 mg/mL 的黄芩提取物处理组孔中几乎没有形成可见生物膜（结果见图2）.结晶紫染色定量结果表明，25、50 mg/mL的黄芩提取物显著降低了脓肿分枝杆菌的生物膜总生物量（ P <0.0001）.黄芩提取物处理脓肿分枝杆菌临床株后，临床株处理组的生物膜生物量显著低于无药对照孔的生物膜生物量（ P <0.05）（结果见图3）.以上结果说明黄芩提取物可以抑制脓肿分枝杆菌的生物膜的形成.

3.3  扫描电子显微镜观察黄芩提取物对脓肿分枝杆菌标准株生物膜形成的影响

设置实验组黄芩提取物浓度分别为0.5×MIC和1×MIC，以及无药生长对照组，对样品进行扫描电镜分析.由生长对照组（结果见图4）可以观察到当脓肿分枝杆菌培养一段时间后，细菌生长良好，大量团聚，会形成连接致密且有一定厚度的生物膜；在25 mg/mL黄芩提取物处理组，细菌数量有一定的下降，生物膜变薄且松散，生物膜的完整性受到影响；在50 mg/mL 黄芩处理组，细菌数目大量下降，且细菌分散，不再团聚成一个整体，生物膜基本消失.上述结果表明，黄芩提取物对脓肿分枝杆菌生物膜的形成有抑制作用.

3.4 分枝菌酸合成相关基因表达量的测定

采用实时荧光定量PCR测定分枝菌酸合成相关基因的相对表达量结果（见图5）.黄芩提取物处理后，分枝菌酸合成相关基因 MAB_2028 ， MAB_2029 ， MAB_2030 ， MAB_2031 ， MAB_2032 ，  MAB_2034 表达量均显著下降（ P <0.01）.以上结果说明黄芩提取物能影响分枝菌酸合成相关基因的下调表达，从而抑制脓肿分枝杆菌的生长及生物膜的形成.

4 讨 论

近年来，世界范围内非结核分枝杆菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）病的发病率和死亡率正稳步上升  ［17-19］.脓肿分枝杆菌作为NTM病常见的感染因子，对大部分抗生素及一线抗结核药物具有高度耐药性，导致治疗效果差，临床诊疗复杂棘手  ［20-22］.脓肿分枝杆菌能够在人肺中形成生物膜生长，并嵌入终末期肺病的肺泡壁中，可能引起的慢性、持续性肺部疾病  ［23］.生物膜的形成是人类 NTM 感染的致病性和耐药性的关键机制，抗生物膜剂成为治疗脓肿分枝杆菌感染的新思路.因此，亟需开发新型药物来治疗脓肿分枝杆菌引起的感染.

研究表明，天然植物黄芩对耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌的MIC为250～1000 mg/mL  ［24］，对诺卡菌的MIC为62.50 g/L，表现出一定的杀灭效果  ［25］.而课题组通过前期的筛选发现天然植物黄芩对脓肿分枝杆菌浮游菌的生长具有抑制作用.本研究通过测定黄芩提取物对浮游菌的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度证实了黄芩提取物可以抑制脓肿分枝杆菌浮游菌的生长，黄芩提取物对脓肿分枝杆菌标准株的MIC  50和 MIC  90分别为3.13 mg/mL和50 mg/mL.我们进一步测试了0.5×MIC（25 mg/mL）的黄芩提取物能有效抑制脓肿分枝杆菌标准株和临床株生物膜的形成，其对生物膜的清除可消除由于生物膜的存在而导致的抗生素耐药性升高.由此可见，黄芩提取物在杀死脓肿分枝杆菌和克服由生物膜引起耐药性方面极具潜力.

脓肿分枝杆菌表现出两种菌落形态：平滑型菌落S（Ma  Sm）和更具抗生素抵抗力的粗糙型菌落R（Ma  Rg）  ［4］.脓肿分枝杆菌复合体可以分为三个亚种：脓肿亚种， 马赛亚种以及博莱亚种.这些亚种之间的区别具有临床意义，感染会表现出不同的药物敏感性测试结果以及临床症状  ［26，27］.在本项研究中，黄芩提取物在脓肿分枝杆菌标准株和临床株S型、R型以及脓肿亚种、马赛亚种中均表现出良好的抗菌作用以及生物膜形成的抑制作用.其它中草药如黄连及香茅草提取物均能抑制脓肿分枝杆菌的生长和生物膜的形成，黄连浓缩膏体MIC为1 mg/mL  ［28］，香茅草精油MIC为3.506 mg/mL  ［29］，红木的水醇提取物BoHE对于马赛亚种的MIC为2.34 mg/mL，但该研究未探究BoHE对脓肿分枝杆菌生物膜的影响  ［30］.以上植物提取物未在脓肿分枝杆菌临床株中进行抑菌及抑制生物膜的研究，而本研究测试了黄芩提取物在脓肿分枝杆菌不同菌落形态、不同亚种的临床株中的抑菌及生物膜抑制效果，使得黄芩提取物在治疗脓肿分枝杆菌感染方面更具有临床意义，为临床生物膜抑制剂的开发提供一定基础.

分枝菌酸是独特的长链脂肪酸，存在于富含脂质的分枝杆菌细胞壁中.新的哌啶醇衍生物PIPD1通过靶向脓肿分枝杆菌的分枝菌酸转运  ［31］、甲氟喹通过干扰分枝菌酸的生物合成  ［32］均表现出明显的脓肿分枝杆菌抑菌活性. MAB_2028 至 2034 基因位于同一个操纵子，研究表明， MAB_2028 ， MAB_2030 ， MAB_2032 都参与脓肿分枝杆菌分枝菌酸的合成  ［33］.在本研究中，黄芩提取物处理后， MAB_2028 ， MAB_2029 ， MAB_2030 ， MAB_2031 ， MAB_2032 ， MAB_2034 的表达量均下调，表明黄芩提取物可能通过影响分枝菌酸的生物合成从而抑制脓肿分枝杆菌的生长及其生物膜的形成.

临床上会发生许多与生物膜相关的感染，一旦在非生物或组织表面上建立了生物膜，使用常规剂量的抗生素几乎不可能根除  ［34］，由抗生素和表现出抗生物膜活性的化合物的联合治疗是解决该问题的一种潜在策略.研究发现黄连及其主要成分小檗碱可以抑制脓肿分枝杆菌的生物膜形成，增强抗生素治疗脓肿分枝杆菌感染的能力  ［28］.黄芩提取物中含有多种不同作用机制的抗菌成分，黄芩单体的抑菌与生物膜抑制作用以及抑制生物膜形成的具体机制有待深入研究与探索.综上所述，黄芩提取物有望成为临床治疗脓肿分枝杆菌感染的新方法.

参考文献：

［1］   De Groote M A， Huitt G. Infections due to rapidly growing  Mycobacteria  ［J］. Clin Infect Dis， 2006， 42： 1756.

［2］  Floto R A， Olivier K N， Saiman L，  et al . US cystic fibrosis foundation and european cystic fibrosis society consensus recommendations for the management of non-tuberculous  Mycobacteria  in individuals with cystic fibrosis ［J］. Thorax， 2016， 71： i1.

［3］  Illouz M， Alcaraz M， Roquet-Banères F，  et al .  Mycobacterium abscessus ， a model of resistance to multiple antibiotic classes ［J］. Med Sci （Paris）， 2021， 37： 993.

［4］  Clary G， Sasindran S J， Nesbitt N，  et al .  Mycobacterium abscessus  smooth and rough morphotypes form antimicrobial-tolerant biofilm phenotypes but are killed by acetic acid ［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2018， 62： e01782.

［5］  Kostakioti M， Hadjifrangiskou M， Hultgren S J. Bacterial biofilms： development， dispersal， and therapeutic strategies in the dawn of the postantibiotic era ［J］. Cold Spring Harb Perspect Med， 2013， 3： a010306.

［6］  Ojha A， Anand M， Bhatt A，  et al . GroEL1： a dedicated chaperone involved in mycolic acid biosynthesis during biofilm formation in  Mycobacteria  ［J］. Cell， 2005， 123： 861.

［7］  龚发萍， 郑鸣福. 黄芩的化学成分及药理作用［J］. 临床合理用药杂志， 2021， 14： 176.

［8］  梅林， 贺锡中， 熊云， 等 中药黄芩的血清抑菌活性试验研究［J］. 医学研究杂志， 2009， 38： 102.

［9］  周雪宁， 权志博， 王雷陕， 等. 五倍子等三种中药体外抗产ESBLs大肠埃希菌研究及其探讨［J］. 陕西中医学院学报， 2009， 32： 80.

［10］  吴静， 胡东， 王克霞. 黄芩和黄芩苷对幽门螺杆菌的体外抗菌活性研究［J］. 中药材， 2008： 707.

［11］ Brackman G， Cos P， Maes L，  et al . Quorum sensing inhibitors increase the susceptibility of bacterial biofilms to antibiotics in vitro and  in vivo  ［J］. Antimicrob Agents Chemother， 2011， 55： 2655.

［12］ 殷姿， 欧宜文， 李蓓， 等. 黄芩对肺炎克雷伯菌抑制作用及其机制研究［J］. 中国病原生物学杂志， 2016， 11： 388.

［13］ Chen W， Li B， Li S，  et al . Effects of scutellaria baicalensis on activity and biofilm formation of  Klebsiella pneumoniae  ［J］. Chin Med Sci J， 2016， 31： 180.

［14］ 何志群， 滕飞， 高超， 等. 夫西地酸联合抗生素抑制脓肿分枝杆菌的研究 ［J］. 四川大学学报： 自然科学版， 2021， 58： 066001.

［15］ Del Rio B， Ladero V， Redruello B，  et al . Lactose-mediated carbon catabolite repression of putrescine production in dairy  Lactococcus lactis  is strain dependent ［J］. Food Microbiol， 2015， 48： 163.

［16］ Arocho A， Chen B， Ladanyi M，  et al . Validation of the 2-DeltaDeltaCt calculation as an alternate method of data analysis for quantitative PCR of BCR-ABL P210 transcripts ［J］. Diagn Mol Pathol， 2006， 15： 56.

［17］ Mirsaeidi M， Machado R F， Garcia J G，  et al . Nontuberculous mycobacterial disease mortality in the United States， 1999-2010： a population-based comparative study ［J］. PLoS ONE， 2014， 9： e91879.

［18］ Namkoong H， Kurashima A， Morimoto K，  et al . Epidemiology of pulmonary nontuberculous mycobacterial disease， Japan ［J］. Emerg Infect Dis， 2016， 22： 1116.

［19］ Yu X， Liu P， Liu G，  et al . The prevalence of non-tuberculous mycobacterial infections in mainland China： systematic review and meta-analysis ［J］. J Infect， 2016， 73： 558.

［20］ Cowman S， Van Ingen J， Griffith D E，  et al . Non-tuberculous mycobacterial pulmonary disease ［J］. Eur Respir J， 2019， 54： 1900250.

［21］ Griffith D E.  Mycobacterium abscessus  and antibiotic resistance： same as it ever was ［J］. Clin Infect Dis， 2019， 69： 1687.

［22］ Griffith D E， Daley C L. Treatment of  mycobacterium abscessus  pulmonary disease ［J］. Chest， 2022， 161： 64.

［23］ Qvist T， Eickhardt S， Kragh K N，  et al . Chronic pulmonary disease with  Mycobacterium abscessus  complex is a biofilm infection ［J］. Eur Respir J， 2015， 46： 1823.

［24］ 唐金蓉， 李盛， 张曼俐， 等. 黄芩、黄连和黄柏对CRKP的抑菌作用研究 ［J］. 医学理论与实践， 2022， 35： 2469.

［25］ 周意， 李秋明， 龙华婧， 等. 黄芩颗粒与抗菌药联合使用对诺卡菌的体外抑菌效果 ［J］. 实用检验医师杂志， 2022， 14： 191.

［26］ Harada T， Akiyama Y， Kurashima A，  et al . Clinical and microbiological differences between  Mycobacterium abscessus  and  Mycobacterium massiliense  lung diseases ［J］. J Clin Microbiol， 2012， 50： 3556.

［27］ Koh W J， Jeon K， Lee N Y，  et al . Clinical significance of differentiation of  Mycobacterium massiliense  from  Mycobacterium abscessus  ［J］. Am J Respir Crit Care Med， 2011， 183： 405.

［28］ Tseng C Y， Sun M F， Li T C，  et al . Effect of coptis chinensis on biofilm formation and antibiotic susceptibility in  Mycobacterium abscessus  ［J］. Evid Based Complement Alternat Med， 2020， 2020：  9754357.

［29］ Rossi G G， Guterres K B， Bonez P C，  et al . Antibiofilm activity of nanoemulsions of  Cymbopogon flexuosus  against rapidly growing mycobacteria ［J］. Microb Pathog， 2017， 113： 335.

［30］ Lima V J， Zagmignan A， Lima L L F，  et al . Hydroalcoholic extract and ethyl acetate fraction of bixa orellana leaves decrease the inflammatory response to  Mycobacterium abscessus  Subsp.  massiliense  ［J］. Evid Based Complement Alternat Med， 2018， 2018： 6091934.

［31］ Dupont C， Viljoen A， Dubar F，  et al . A new piperidinol derivative targeting mycolic acid transport in  Mycobacterium abscessus  ［J］. Mol Microbiol， 2016， 101： 515.

［32］ Degiacomi G， Chiarelli L R， Recchia D，  et al . The antimalarial mefloquine shows activity against  Mycobacterium abscessus ， inhibiting mycolic acid metabolism ［J］. Int J Mol Sci， 2021， 22： 8533.

［33］ Dokic A， Peterson E， Arrieta-Ortiz M L，  et al .  Mycobacterium abscessus  biofilms produce an extracellular matrix and have a distinct mycolic acid profile ［J］. Cell Surf， 2021， 7： 100051.

［34］ Kouidhi B， Al Qurashi Y M， Chaieb K. Drug resistance of bacterial dental biofilm and the potential use of natural compounds as alternative for prevention and treatment ［J］. Microb Pathog， 2015， 80： 39.