一种新型双酶体系快速检测葡萄糖的方法

王振涛，许蓓蓓，程晓宏

1. 南通市产品质量监督检验所（南通 226011）；2. 南通市食品药品监督检验中心（南通 226006）；3. 南通市疾病预防控制中心（南通 226007）；4. 南通市食品危害因子分析重点实验室（南通 226011）

葡萄糖是生命活动的重要能量物质，其浓度水平是糖尿病诊断的一项重要生化指标。糖尿病是由饮食、遗传等因素共同作用而引起的以糖代谢紊乱为主要症状的慢性病，可引起失明、肾脏病、心脏病及神经损伤等[1]。因此，快速准确检测食品和血液中葡萄糖含量对于糖尿病的治疗和控制有重大意义。

国内外快速检测葡萄糖方法主要有高效液相色谱法[2-3]、煮沸滴定法[3]、辣根过氧化物酶法[4-6]、过氧化物模拟酶法[7-8]、纳米粒子模拟酶法[9-16]、荧光光谱法[17-19]和生物传感器[20-22]。由于天然酶具有高效催化功能、高度专一性和高度受控性，是检测葡萄糖的主要手段，但同时天然酶也具有稳定性差、易失活、不易制备等缺点，使其在实际应用过程中受限。经过长时间实践发现，上述检测方法存在缺陷有：试剂合成工艺复杂，对检测仪器或设备要求高；检测使用的天然生物酶价格昂贵，导致生产成本增高；检测工序步骤过多，费时费力，难以快速实施。因此，建立一种低成本、快速简便、灵敏较高的检测葡萄糖方法十分重要。

天然存在酶具有高效催化活性、高度选择性和高度受控性的一类特殊蛋白质，但是天然酶具有稳定性差、成本较高、易失活和不易制备等缺点，使其在实际检测过程中受限。试验针对检测葡萄糖的方法缺点（如天然酶昂贵且稳定性差，试剂昂贵，复杂设备，合成路线繁琐，费时费力等），以期提供一种廉价易得、操作简单和快速高效的检测葡萄糖方法，可应用于食品安全、临床检验等领域。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

圆二色谱仪（Jasco J-815，Japan）；超纯水机（Milli-Q，密理博上海公司）；离心机（MIKRO 220R，德国Hettich公司）；分光光度计（WFJ7200，苏州赛恩斯公司）；电子分析天平（CPA225D，德国赛多利斯公司）；数显恒温水浴锅（HH-2，国华仪器制造有限公司）。

葡萄糖氧化酶（生物试剂）、葡萄糖、30% H2O2、HCl、KCl、NaCl、三羟基氨基甲烷（Tris）、底物2, 2’-连氮基-双-（3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸）二铵盐（ABTS）、Triton X-100表面活性剂、二甲基亚砜（均为分析纯）；二级纯水（由Millipore纯水仪制备）；G4-DNA VEDF序列为5’-(G3C)2CG5CG3-3’。

1.2 溶液的配制

1.2.1 缓冲溶液的配制

用HCl调节缓冲液Tris的pH，依次添加NaCl、KCl，添加Triton X-100表面活性剂，得到缓冲液为20 mmol/L pH 7.4 Tris/HCl，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl和0.03% Triton X-100。

1.2.2 G4-DNA溶液的配制

将G4-DNA用缓冲液溶解，并在95 ℃下加热5 min，加热结束后迅速在冰上冷却至室温，4 ℃静置过夜，浓度为10 μmol/L，备用。

1.2.3 氯化血红素hemin溶液的配制

hemin用二甲基亚砜溶解得10 mmol/L hemin储备液，于-20 ℃保存，将hemin工作液用缓冲液稀释成合适的氯化血红素hemin溶液，浓度为20 μmol/L，备用。

1.2.4 底物ABTS、过氧化氢溶液制备

用缓冲液配制得10 mmol/L底物ABTS工作液溶液，于4 ℃棕色保存备用。

取质量分数30%的过氧化氢溶液，先用纯水稀释至物质浓度100 mmol/L，用缓冲溶液将其稀释成工作液，临用前现配。

1.2.5 葡萄糖、葡萄糖氧化酶溶液标准系列配制

葡萄糖固体先用纯水稀释至浓度10 mmol/L，用缓冲溶液将其按浓度梯度稀释至0，0.125，0.250，0.500，1.00和2.500 mmol/L的浓度梯度溶液，临用现配。

用缓冲液稀释10倍，得浓度23.8 U/mL的葡萄糖氧化酶溶液，临用现配。

1.3 过氧化物模拟酶的构建

将上述1.2.2中的G4-DNA溶液与1.2.3中的氯化血红素hemin溶液等体积混合，室温孵育1 h，即可构建氧化物模拟酶，浓度为5 μmol/L。

1.4 圆二色谱试验

DNA使用1.2.1缓冲液配制；DNA与hemin的浓度比为2︰1。400 μL DNA与DNA/hemin溶液置于 1 cm比色皿中，扫描收集220~320 nm范围内的圆二色谱，扫描速率为500 nm/min。为便于比较，所得的圆二色谱均为扣除背景、平滑处理、浓度校准后的结果。

1.5 葡萄糖定性/半定量分析

依次吸取50 μL 1.2.5中配制的不同浓度梯度葡萄糖溶液，并分别与50 μL葡萄糖氧化酶溶液混合于酶标板微孔中，反应10 min后，依次加入50 μL浓度5 μmol/L的VEGF/氯化血红素过氧化物模拟酶和50 μL浓度10 mmol/L的底物ABTS溶液于微孔中，手轻微平移摇动混匀进行反应，10 min后将各反应后的溶液按浓度梯度排列。根据溶液的变化情况来定性筛查样品中是否存在葡萄糖。将其溶液颜色和对应的葡萄糖浓度制作标准比色卡的色阶，作为葡萄糖的半定量分析依据。

1.6 样品处理方法

称取1 g（精确到0.01 g）粉碎均匀的苹果试样，加50 mL缓冲液充分摇匀，静置5 min后，取50 μL上清液，按照上述1.5步骤进行定性筛查和半定量分析；在100 μL原始血清中加入1.0 mL三氯乙酸（0.6 mol/L）沉淀蛋白质，在10 000 r/min下离心后，将上清液移至5 mL容量瓶，用缓冲液定容，取50 μL上清液，按照上述步骤1.5进行半定量分析。

2 结果与讨论

2.1 圆二色谱图谱

G-四链体结构呈现的圆二色谱CD信号取决于链的方向，平行G-四链体结构具有264 nm左右的正峰和240 nm左右的负峰[23]。从图1可以看出，G4-DNA VEDF在缓冲液中以平行结构。加入hemin后，hemin诱导VEGF形成的更稳定的分子内平行结构。而分子内平行结构的G4-DNA具有很强的过氧化物酶活性[23]，为建立快速检测过氧化氢奠定理论基础。

图1 VEGF及VEGF/hemin（浓度比2︰1）复合物的CD光谱

2.2 检测条件的选择

G4/hemin模拟酶在室温、弱碱性条件下活性较高[23-24]。因此，选择常温、接近人体液弱碱性pH 7.4用于葡萄糖的分析检测。

由于分子内平行结构G4与hemin是采用上下末端堆积形成的[23,25]，即G4与hemin的最佳浓度比为2︰1。由图1可知，hemin使得VEGF形成更稳定平行结构，进而使得VEGF/hemin模拟酶更高的稳定性和酶活性。因而，VEGF/hemin浓度比选2︰1。

比较1，2，5，10和20 μmol/L（过氧化物模拟酶终浓度）对催化反应的影响：较小浓度1和2 μmol/L过氧化物模拟酶时，催化反应所需时间较长；较大浓度10和20 μmol/L时，降解所需时间较短，催化效果太好，不容易区分葡萄糖的浓度。故选择中等浓度的5 μmol/L（终浓度）过氧化物模拟酶用于酶催化反应。

由于VEGF/hemin模拟酶具有过氧化物酶活性，也具有过氧化氢酶活性，及酶催化的专一性较强，考察乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖等物质对模拟酶体系无干扰。

偶联VEGF/hemin过氧化物模拟酶和葡萄糖氧化酶双酶系统活性较强，反应5 min后即可观察到颜色的变化，可用于定性筛查葡萄糖。反应10~15 min后，所观察到颜色基本稳定，可用于半定量分析葡萄糖。反应超过20 min后，所观察到颜色可能会因为过量的过氧化氢漂白褪色。故选择催化反应5 min后，可用于快速定性筛查。催化反应10 min后，可用于半定量分析。

2.3 葡萄糖定性筛查

吸取50 μL待测样品溶液和50 μL葡萄糖氧化酶溶液混合于酶标板微孔中，反应10 min后，依次加入50 μL 5 μmol/L的VEGF/hemin过氧化物模拟酶和50 μL 10 mmol/L的底物ABTS溶液于微孔中，移液枪吹打混匀进行反应，5 min后通过肉眼观察溶液的从无色变成绿色，即可初步判断存在葡萄糖。

2.4 葡萄糖半定量分析

依次吸取50 μL 1.2.5中配制的不同浓度梯度葡萄糖溶液，并分别与50 μL葡萄糖氧化酶溶液混合于酶标板微孔中，反应10 min后，依次加入50 μL 5 μmol/L的VEGF/hemin过氧化物模拟酶和50 μL 10 mmol/L的底物ABTS溶液于微孔中，移液枪吹打混匀进行反应，5~10 min后将各反应后的溶液按浓度梯度排列，将其溶液颜色和对应的葡萄糖浓度制作标准比色卡的色阶，作为葡萄糖的半定量分析依据。

图2 双酶体系半定量分析过氧化氢标准色阶图

2.5 样品分析

2.5.1 苹果中葡萄糖的快速检测

称取1 g（精确到0.01 g）粉碎均匀的苹果试样，加50 mL缓冲液充分摇匀，静置5 min后，取50 μL上清液进行定性筛查和半定量分析，其检测结果如图3（A）所示。该苹果中存在一定量的葡萄糖，且溶液葡萄糖浓度约2.5 mmol/L，经计算得苹果试样中的葡萄糖含量约2.25%，与文献报道的苹果中葡萄糖含量2.5%~3.5%接近。

图3 双酶体系快速检测葡萄糖图

2.5.2 人血清中葡萄糖的快速检测

在100 μL原始血清中加入1.0 mL三氯乙酸（0.6 mol/L）沉淀蛋白质，在10 000 r/min下离心后，将上清液移至5 mL容量瓶，用缓冲液定容，取50 μL上清液进行定性筛查和半定量分析，其检测结果如图3（B）所示。该人血清样品中存在一定葡萄糖，且葡萄糖溶液浓度约1.0 mmol/L，经计算得原始血清葡萄糖含量约5.0 mmol/L，属于正常血糖浓度范围。

3 结论

试验采用偶联过氧化物模拟酶和葡萄糖氧化酶双酶系统，通过肉眼判断酶催化作用后，体系颜色的变化和深浅用于快速定性和半定量分析葡萄糖，其构建成本较低，方法简便，稳定性和重复性良好，可推广应用到食品安全和临床检验等各种领域中的葡萄糖快速分析，应用前景广阔。