核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3炎症小体在肝损伤中的作用及中医药的靶向调控

曹杨港,曾胜澜,陈玮钰,谭利婷,毛德文

(1. 广西中医药大学第一临床医学院,广西 南宁 530001;2. 广西中医药大学第一附属医院,广西 南宁 530001)

炎症小体作为机体固有免疫系统的感受器,能够识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs),并通过信号转导诱导细胞活化,导致各种炎症介质及细胞因子的释放,从而诱发炎症反应[1]。短期、恰当、可控的炎症反应是机体天然免疫系统清除和抵御有害病原体或刺激及促进损伤修复的有力武器,但长期、过度、失控的炎症反应可触发自身免疫系统功能失控,反而造成机体组织、细胞损伤。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(Nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)炎症小体能够对来源广泛、成分和结构各异的多种刺激因子作出反应,因此它的生物功能和涉及的疾病范围也是所有炎症小体中最为广泛的,同时也是研究得最为广泛、深入的炎症小体[2]。肝脏作为人体重要的代谢器官和免疫器官,在维持机体代谢和免疫稳态中发挥着极其重要的作用。NLRP3炎症小体的激活参与了肝脏的天然免疫防御反应,介导了细胞焦亡和炎症反应,促进了肝脏组织和细胞损伤的发生发展[3]。作为肝损伤治疗重要的调控靶点,NLRP3炎症小体的活化机制研究与靶向调控成为了近年来研究的热点。

1 炎性小体NLRP3的构成

炎症小体是主要由受体蛋白NLRP3、接头蛋白凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing Caspase-recruitment domain,ASC)以及效应蛋白含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)组成的多蛋白复合体。受体蛋白NLRP3依据蛋白的结构和功能划分为N端吡啶结构域(pyrin domain, PYD)、中央核苷酸结合寡聚结构域(nucleoside triphosphatase domain, NACTH)和C端富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeat, LRR);位于N端的PYD区域可以与其他蛋白的PYD结构域结合,形成PYD-PYD复合物,向下游传递信号,具有招募和连接作用[4];NACHT结构域可与三磷酸腺苷结合,将其水解为二磷酸腺苷,释放能量,并对NLRP3下游蛋白发挥重要调控功能;LRR区域富含高度保守的亮氨酸重复序列,具有正电性[5]。ASC 包含两个重要的结构域即PYD和Caspase募集结构域(Caspase recruitment domain,CARD),起到了连接受体蛋白和效应蛋白的桥梁作用,其N端PYD 结构域与NLRP3的PYD结构域结合并相互作用,C端的CARD结构域招募含有 CARD结构域的前体分子pro-Caspase-1,其自我剪切并活化为Caspase-1,最终组装成NLRP3炎症小体[6]。

2 NLRP3炎症小体的激活机制

2.1NLRP3炎症小体激活的启动步骤 仅受到刺激因子的刺激并不足以诱导NLRP3炎症小体的直接激活,其激活首先需要经过启动步骤。NLRP3蛋白主要在树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞中表达[7],NLRP3在静息状态下保持不足以启动炎症小体激活的低表达水平,而白细胞介素(interleukin,IL)-1β前体(pro-IL-1β)在静态的免疫细胞中无结构性表达,免疫细胞必须首先暴露在启动刺激下,例如Toll样受体、NOD样受体或细胞因子受体的配体中,转录因子核因子-κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)激活,从而上调NLRP3和pro-IL-1β的表达[8-9]。在启动步骤中,ASC、pro-Caspase-1和IL-18前体(pro-IL-18)的表达水平不受影响[8]。此外,NF-κB信号通路的信号分子髓样分化因子和β干扰素Toll/IL-1受体结构域衔接蛋白也参与调节了对NLRP3和pro-IL-1β的诱导,在启动步骤中,细胞凋亡信号分子Caspase-8和FAS相关死亡结构域蛋白也能上调NLRP3的表达,而且它们的作用不依赖于其凋亡功能[10]。

2.2NLRP3炎症小体激活的活化步骤 在外源性微生物及内源性危险信号等刺激因子诱导下,NLRP3炎症小体启动各组分的招募、组装与活化,此为NLRP3炎症小体激活的第二步-活化步骤,NLRP3炎症小体激活的活化步骤涉及的具体分子机制较为复杂,涉及离子调节、活性氧和线粒体功能障碍以及溶酶体损伤等。

2.2.1离子调节 大多数NLRP3炎症小体的刺激因子都能引起K+外流,经过刺激因子处理过的细胞中,K+外流是常见的离子事件,细胞质内K+的耗竭介导了暴露于NLRP3刺激因子(三磷酸腺苷或尼日利亚菌素)的巨噬细胞和单核细胞中IL-1β的成熟和释放[11]。刺激因子激活嘌呤能受体家族中的配体门控离子通道P2X7受体后,细胞膜上的离子通道被打开,造成K+外流,Ca2+内流,胞内K+水平降低,并且募集半通道蛋白Pannexin-1,使得细胞膜上形成孔道,导致刺激因子直接进入胞内,导致炎症小体激活[12-13],而细胞内Ca2+的增加会导致线粒体钙过载,从而引起线粒体功能障碍,导致NLRP3炎症体激活[14]。此外,研究发现,NLRP3刺激因子单钠尿酸在输送到溶酶体后,使得细胞内Na+内流,引起细胞内渗透压升高,导致水分子内流和细胞肿胀,进而稀释性地将K+浓度降低到90 mM阈值以下,从而诱导NLRP3炎症小体激活[15]。研究发现[16-18],包括容积调控阴离子通道和细胞内氯离子通道(chloride intracellular channels,CLICs)在内的Cl-通道,参与了NLRP3炎症体的激活,且Cl-通道阻滞剂氟芬那酸、甲芬那酸和5-硝基-2-苯甲酸可阻断NLRP3炎症体的激活,细胞内CLIC1和CLIC4转移到细胞膜上,可触发Cl-外流,并通过促进NLRP3与无丝分裂基因 A相关蛋白激酶7相互作用,参与NLRP3炎症小体的激活[19]。目前Cl-外流如何促进NLRP3与无丝分裂基因 A相关蛋白激酶7的相互作用以及各离子通道如何协作促进炎症小体活化,有待进一步深入研究。

2.2.2活性氧(reactive oxygen species,ROS)与线粒体功能障碍 Pétrilli等[20]研究发现,经NLRP3激活剂处理后,可检测到胞浆内ROS水平升高,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶是胞浆ROS生成的主要来源,也是NLRP3炎症小体激活的常见信号。在正常生理条件下,硫氧化还原蛋白(thioredoxin,TRX)与硫氧还蛋白互作蛋白(thioredoxin-interacting protein,TXNIP)结合,组成非活性复合物;当ROS水平增加时,该复合物发生解离,TXNIP与NLRP3的LRR结构域结合,进而激活NLRP3,促进其与ASC蛋白的结合,加速NLRP3炎症小体完成组装及激活的进程[21-22]。线粒体功能障碍会导致氧化呼吸链抑制,引起线粒体ROS的产生,从而促进NLRP3激活[23]。而线粒体ROS可以氧化线粒体DNA片段,氧化的线粒体DNA释放至胞浆,可与NLRP3直接结合并相互作用,最新研究[24]发现其是NLRP3炎症小体激活所必需的条件。此外,线粒体内膜的主要磷脂心磷脂[25]、外膜的跨膜蛋白线粒体融合蛋白2[26]以及信号调节因子线粒体抗病毒信号蛋白[27]也被报道参与了NLRP3炎症小体的激活。

2.2.3溶酶体破裂 溶酶体是由厚约7～10 nm的单层膜包被的囊状结构细胞器,直径约0.2～0.8 μm,内含可分解内源性和外源性大分子物质的水解酶,组织蛋白酶(cathepsins,CTS)是溶酶体内含量最丰富的水解酶之一。NLRP3刺激因子二氧化硅、尿酸钠晶体、β-淀粉样蛋白等颗粒物质被吞噬细胞内吞后,会导致溶酶体膜损坏破裂,释放CTS[28],CTS的释放可能导致质膜通透性增加或离子通道激活,从而导致K+外流,介导下游的NLRP3炎症小体激活[13],还可能通过促进ROS生成来诱导炎症小体的激活[29]。有报道称,溶酶体CTSB的释放是IL-1β释放的必要条件[30];经CTSB抑制剂处理过的巨噬细胞中,由颗粒物质激活的NLRP3炎症小体的激活被抑制[31]。除CTSB外,组织蛋白酶C、L、S和Z在被三磷酸腺苷、单钠尿酸盐或细菌成分等激活后,也单独或协同参与了NLRP3炎症小体的激活[32],但是如何单独或协同促进NLRP炎症小体激活的机制尚未明确。此外,最新研究发现暴露于刺激因子中后,高尔基体反面网络结构会特异性解体,诱导处于细胞质基质内的NLRP3转运和聚集,并进一步去泛素化和乙酰化,从而促进炎症小体的组装与激活[33]。一旦NLRP3炎症小体组装完成并激活,将主要通过以下方式诱导炎症反应和细胞焦亡,一方面,pro-Caspase-1自我切割和激活为Caspase-1,Caspase-1进一步切割无活性的IL-1β和IL-18前体,促进炎症因子IL-1β和IL-18的成熟与活化,触发相关信号通路,进而促进IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等多种炎症因子、黏附分子和趋化因子分泌,招募炎症细胞,诱导“瀑布式”炎症级联反应[34];另一方面,活化的Caspase-1还可切割打孔蛋白消皮素D(gasdermin D,GSDMD),并释放其N端结构域,与细胞膜上的磷脂蛋白结合,形成孔隙,导致细胞肿胀和胞膜破裂,介导包括IL-1β和IL-18在内的细胞内容物的释放,诱导炎症反应和细胞焦亡[35]。最新研究[36]发现,建立敲除GSDMD的NLRP3突变小鼠模型后,经刺激因子脂多糖处理后,仍可分泌大量IL-1β和IL-18,并且诱导细胞焦亡;进一步的机制研究发现在GSDMD缺失时,NLRP3炎症小体激活触发了Caspase-8/3通路,并切割了另一个消皮素家族成员Gasdermin E,介导炎症因子释放,诱导细胞焦亡。

3 NLRP3炎症小体在肝损伤中的作用

在肝脏疾病、药物和化学因素、脓毒症、肝脏缺血再灌注损伤(hepatic ischemia/reperfusion injury,HIRI)等多种原因诱发的肝损伤中,NLRP3炎症小体激活均发挥了重要作用。Wree等[37]的研究发现,NLRP3炎症小体过度激活的小鼠肝组织pro-IL-1β、ASC、Caspase 1、TNF-α表达增加,且发生了中性粒细胞浸润的严重炎症,此外,细胞染色结果提示合并存在严重的肝细胞焦亡。NLRP3有助于维持肠道内环境平衡和调节肠道微生态,在原发性硬化性胆管炎诱发的胆汁淤积性肝损伤中,其机制除了胆汁淤积造成直接的肝细胞损伤外,还包括胆汁酸代谢变化影响到肠肝循环,从而打破肠道微生态的稳态,诱发肠道菌群失调,引起肠屏障功能障碍,增加细菌移位,内毒素进入门静脉后,显著激活肝脏中NLRP3炎症小体,导致肝损伤加重[38]。也有研究[39]发现,在急、慢性胆汁淤积性肝损伤中,炎症小体的活化有着截然不同的作用,炎症小体激活可拮抗急性胆汁淤积性肝损伤,但却加重慢性胆汁淤积性肝损伤。戊型肝炎病毒感染可诱导IL-1β的产生显著增加,促进病毒复制并拮抗干扰素反应,造成肝细胞损伤,其机制与激活NF-κB信号通路,从而诱导NLRP3炎症小体激活有关[40]。碲化镉量子点作为重要的成像和药物传递工具,肝脏是其进入体内的主要积聚器官,当肝细胞暴露于远低于致死剂量的碲化镉量子点时,会在肝细胞中发生局部积累,并伴有细胞炎症损伤和坏死,作用机制与其诱导ROS产生,从而触发NF-κB介导的NLRP3炎症小体激活有关[41]。镉元素的过量摄入会造成肝脏损伤,在肝组织中检测到TNF-α、单核细胞趋化蛋白-1、促炎细胞因子(IL-1α、IL-1β和IL-18)、NLRP3、ASC、Caspase 1的表达及TUNEL染色阳性细胞均明显增加,说明其致肝损伤的机制与激活NLRP3炎症小体诱发炎症反应和细胞凋亡增加相关[42]。过量的对乙酰氨基酚(APAP)会导致严重的炎症反应与大量的肝细胞坏死,经过量APAP处理过的小鼠模型,IκB 激酶复合体表达、NF-κB转录及易位、NLRP3和Caspase-1的表达显著增加,同时程序性细胞死亡的标志物磷酸化混合系激酶区域样蛋白表达增加,说明APAP通过NF-κB/NLRP3激活炎症小体并启动程序性细胞死亡造成肝损伤[43]。最新研究[44]发现,暴露于过量APAP中时,线粒体自噬会增加并通过抑制NLRP3炎症小体活化来拮抗APAP诱导的小鼠急性肝损伤。肝脏是脓毒症急性期最常受损的靶器官之一,脓毒症并发肝损伤临床常见,Chen等[45]研究发现,脓毒症肝损伤小鼠肝组织Caspase 1、NLRP3、IL-1β和IL-18表达显著增加,致肝损伤机制可能与激活NLRP3炎症小体加剧肝细胞凋亡有关。HIRI是失血性休克及肝部分切除、肝移植等肝脏外科手术的常见并发症。HIRI发生后,会诱导DAMPs产生,并与枯否细胞中的 Toll样受体结合,增加线粒体 ROS 的产生,还会导致CTSB释放,从而激活NLRP3炎症小体加重肝损伤;而NLRP3的敲除可减少中性粒细胞向缺血性肝组织的浸润,减少炎症损伤[46]。NLRP3炎症小体的过度激活在肝损伤中发挥了重要作用,炎症小体过度激活后,往往伴有肝脏的炎症反应加重,细胞焦亡及细胞凋亡增多,NLRP3炎症小体及相关信号通路作为肝损伤的重要靶点,对其进行深入研究有助于为肝损伤的防治寻求新的切入点和突破口。

4 靶向调控NLRP3及相关信号通路拮抗肝损伤

4.1中药单体 红景天具有益气活血、通脉平喘之效,《神农本草经》谓其可“主大热,火疮,身热烦,邪恶气”。红景天苷是其提取物,具有清除自由基、调节免疫、抗脂质过氧化、抗衰老的药理作用;红景天苷可降低凋亡相关蛋白Caspase-3,8,9和B淋巴细胞瘤-2基因相关X蛋白表达,上调抗凋亡蛋白B淋巴细胞瘤-2基因表达;增加抗氧化酶如谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性,降低氧化应激标志物丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)和促炎细胞因子TNF-α、IL-6 mRNA的水平,抑制细胞色素P450 2E1的表达,下调了NLRP3、ASC、Caspase-1和IL-1β的表达,通过抑制NLRP3炎症小体激活,缓解氧化应激、减轻炎症反应、减少细胞凋亡,呈剂量依赖性地减轻四氯化碳(CCl4)诱导的小鼠急性肝损伤[47]。还可通过增加Beclin-1蛋白表达,降低P62蛋白表达,增加自噬,抑制NLRP3的活化[48]。

《本草拾遗》认为黄栌可以“除烦热,解酒疸,疗目黄”。漆黄素是中药黄栌的提取物,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤的药理作用;漆黄素可增加HIRI小鼠肝脏中磷酸化糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)、磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)蛋白表达,下调NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、cleaved Caspase-1、IL-18和 IL-1β)表达和 NLRP3的mRNA 表达,减少血清炎症因子IL-1β、IL-18 和 TNF-α的释放,通过调控GSK3β/AMPK/NLRP3信号通路,减少炎症反应,从而减轻了HIRI[49]。

冬凌草有清热解毒、活血止痛的功效。冬凌草素是从其中提取的活性成分,具有抗炎、调节免疫、抗肿瘤、解痉的药理作用,研究发现,冬凌草素显著降低了急性肝损伤小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎细胞因子水平,同时显著降低了NLRP3、Caspase-1、IL-18和IL-1β等NLRP3炎症小体相关蛋白的表达,其减轻急性肝损伤的机制可能与抑制NLRP3炎症小体相关信号通路,减少肝脏炎症反应相关[50]。

中药大黄具有清热泻火、凉血解毒的功效。大黄素甲醚是中药大黄的提取物,研究发现,大黄素甲醚可降低药物性肝损伤小鼠血清AST、ALT水平,改善肝脏组织病理改变,降低肝组织MDA水平,高迁移率族蛋白B1(high mobility group protein 1,HMGB1)、NLRP3、Caspase-1蛋白和mRNA表达量,IL-1β、IL-18 mRNA表达量,显著提升肝组织GSH活性。其对药物性肝损的保护作用可能与其下调HMGB1/NLRP3炎性小体信号通路抑制炎症小体激活,缓解氧化应激,减少炎症反应有关[51]。

中药姜黄具有破血行气、通经止痛之效。姜黄素是其提取物,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗纤维化、降脂的药理作用;研究发现,应用姜黄素治疗后,黄曲霉素B1诱导的肝损伤小鼠的转氨酶显著下降,组织病理改变改善;肝组织的NLRP3、Caspase-1和细胞焦亡相关蛋白GSDMD表达降低,血清炎症因子IL-1β、IL-18释放减少,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、SOD和CAT活性均升高,MDA含量显著降低,核因子-E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)的表达上调,通过抑制NLRP3炎症小体激活和Nrf2信号通路缓解氧化应激,减少炎症反应和细胞焦亡来减轻肝损伤[52]。

金银花和菊花都具有清热解毒、疏散风热之效。木犀草素是中药金银花、菊花的提取物,具有抗炎、抗过敏、抗病毒等药理作用;研究发现,其可明显改善脂多糖诱导的急性肝损伤小鼠的肝脏组织病理改变,降低转氨酶水平,显著降低了MDA水平,诱导型一氧化氮合酶、TXNIP、NF-κB p65的表达和TNF-α、IL-10、IL-6、IL-1β、IL-18的mRNA的表达,同时抑制了NLRP3、ASC、Caspase-1的表达,显著增加了GSH、SOD的水平和Nrf2蛋白表达,其机制与调控TXNIP/NLRP3炎症小体信号通路,缓解氧化应激,减少炎症反应相关[53]。

可靶向调控NLRP3炎症小体发挥护肝作用的中药单体大都具有清热解毒、活血行气之效,今后可注重对此类中药单体的护肝临床疗效及作用机制的研究与探讨;把握炎症小体活化的合理区间,探究最佳疗效剂量,实现精准调控;着眼于炎症小体活化的机制及相关靶点研究新进展,全面阐释中药单体调控炎症小体的科学内涵。

4.2中药复方 茵陈芍甘汤是由茵陈蒿汤合芍药甘草汤合方而成,具有清热解毒、利湿退黄、柔肝缓急之效。研究发现,茵陈芍甘汤可降低内毒素性急性肝损伤大鼠血清中促炎细胞因子IL-1β水平以及肝组织Caspase-1、Cryopyrin蛋白的表达水平,减少肝组织炎症细胞浸润,改善肝脏组织病理改变,可能是通过抑制NLRP3 炎症小体过度活化,减少炎症反应发挥保护肝细胞的作用[54]。

扶正养肝合剂由当归、五味子、枸杞、虫草菌丝组成,具有补气养血、扶正固本之效;研究发现,其可改善急性肝损伤小鼠肝脏组织病理改变,减少巨噬细胞浸润;降低MDA并提高GSH水平和抗氧化能力指数;减少血清炎症因子IL-1β和TNF-α的释放及肝细胞凋亡;下调肝脏中NLRP3炎症小体的组成成分Caspase-1和IL-1β的表达,其护肝作用机制与抑制 NLRP3 炎症小体激活,降低氧化应激,减轻炎症反应,减少细胞凋亡相关[55]。

健脾理气方由黄芪、白术、薏苡仁、白芍、神曲、云苓、法半夏、柴胡、郁金组成,具有补益正气、健脾祛湿、疏肝理气、散结消痞的功效,结合网络药理学预测和动物实验发现,其可改善急性肝损伤大鼠的肝脏组织损伤,显著降低血清ALT、AST、GGT、IL-18、NF-κB水平,下调肝组织NLRP3、ASC、Caspase-1表达,其拮抗肝损伤的分子机制可能与抑制NF-κB/NLRP3信号通路,从而抑制NLRP3炎症小体过度激活,减少炎症反应有关[56]。

降脂颗粒由绞股蓝、虎杖、丹参、茵陈、荷叶组成。研究发现,其可显著改善脂毒性肝损伤小鼠的组织病理改变,降低肝组织NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、解偶联蛋白2的mRNA表达水平及cleaved-Caspase-1与pro-Caspase-1蛋白表达比值,同时c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和c-Jun蛋白表达受到明显抑制,其分子机制可能是降低解偶联蛋白2表达及抑制JNK/c-Jun信号通路激活,从而抑制NLRP3炎症小体的激活,减少炎症反应有关[57]。

综上,中药复方大都兼顾扶正与祛邪,启示我们在治疗肝损伤时,应该考虑其病机以虚实夹杂为主,遣方用药应注意补虚泄实并重,注重恢复脏腑功能的阴阳平衡,达到“阴平阳秘,精神乃至”的理想状态,这与调控NLRP3炎症小体,从而将天然免疫系统及炎症反应水平控制在合理可控区间的平衡状态的西医作用机制相契合;中药复方具有多靶点、多层次、多效应的特点,目前针对中药复方的研究相对较少,今后加强对中药复方的研究,注重阐明调控NLRP3机制的同时,还应加强不同靶点及通路间协同串联作用的研究及安全性研究。

5 小结与展望

近年来,NLRP3炎症小体相关研究的进展与突破,有助于阐明其在肝损伤中的作用机制和寻找新的药物靶点;也为肝损伤的中医药防治提供了科学依据。今后应进一步深化对炎症小体激活机制的研究,探究更多调控炎症小体激活的药物靶点,推动新型药物研发与应用;炎症小体激活是一把双刃剑,合理可控的激活有助于清除和抵御有害物质以及促进组织修复,下一步的研究需探究NLRP3炎症小体激活的合理区间,开发新型靶向调控药物,明确兼顾安全性与疗效的最佳剂量,扬长避短,做到精准调控。可开展基于NLRP3炎症小体的药物肝毒性研究,推动药物毒理学及临床用药安全性研究的开展。可进一步深入开展对包括中药单体、中药复方在内的天然药物NLRP3炎症小体抑制剂的研究,探讨和阐释不同中药功效与调控NLRP3炎症小体的联系,发掘、筛选及组合更加优质高效的药物,为肝损伤防治提供更多药物选择。深度结合网络药理学、生物信息学、多组学技术、动物实验,探讨炎症小体在肝损伤中的作用机制,验证与阐释中医药调控NLRP3炎症小体及相关信号通路的拮抗肝损伤的科学内涵,推动肝损伤防治的科学研究与临床的进步。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。