治疗用噬菌体的优点、问题与对策

◆作者：杭柏林 李雯琪 曹荔

◆单位：河南科技学院动物科技学院

抗生素的负面作用日益严重，世界很多国家和地区逐渐禁止使用抗生素促生长剂，中国于2020 年开始禁止在饲料中添加任何抗生素。因此，抗生素替代品就受到了人们的广泛关注。其中，噬菌体（bacteriophage，phage）是一种较好的抗生素替代品，有着广阔的临床应用前景。噬菌体是感染、裂解细菌的病毒，在自然界中广泛存在。根据裂解效应的差异，可分为裂解性噬菌体（或称烈性噬菌体、毒性噬菌体）和溶原性噬菌体（或称温和噬菌体）。裂解性噬菌体可直接裂解宿主细菌，导致其死亡。溶原性噬菌体大多数情况下会将其基因组整合到宿主菌的染色体上，并随着宿主菌基因组的复制而复制，通常情况下并不裂解宿主菌。因此，临床上常常使用裂解性噬菌体（下文中都简称为噬菌体）来预防和治疗细菌性感染。噬菌体对真核细胞没有毒害作用，在“后抗生素时代”被认为是具有较好前景的抗生素替代品（侯忠余等，2022）。虽然噬菌体治疗方法在20 世纪初已出现，但现在的“复兴”趋势却是由细菌耐药危机驱动而形成的。近年来，随着细菌耐药性的日益严重，噬菌体在对抗细菌感染方面的作用再次受到广泛关注。目前，作为一种天然“抗菌药物”，噬菌体在较多领域如养殖、食品、医疗等都有较好的应用，被认为是对抗致病菌的重要武器。本文主要就噬菌体的优点、问题与对策进行简要介绍，希望为噬菌体制剂的临床应用与开发提供一些参考。

1 优点

与抗生素相比，噬菌体具有很多优点。这些优点是噬菌体吸引人们研究与使用的“驱动力”。

1.1 特异性强

噬菌体一般只杀灭对应宿主细菌，通常不会跨越种或属的界限。噬菌体能专一地引起宿主细胞的裂解而导致细菌死亡，为致病菌的防控提供了一种新的手段（侯忠余等，2022）。这种特异性与细菌表面受体和噬菌体表面受体结合蛋白（反受体）的相互作用有关（Flayhan 等，2012）。虽然随着噬菌体与宿主菌的相互作用以及研究的不断深入，这种特异性或专一性会逐渐被“打破”，但相对于抗生素、抗菌肽、中药制剂等抗菌物质而言，噬菌体的特异性还是很强的。

1.2 安全、无残留

噬菌体对人和动物没有毒副作用，不会产生残留（周艳等，2014；孙利厂等，2018），被认为对人和动物是安全的（Yen 等，2017；吕霖等，2019；Rehman s等，2019）。噬菌体进入机体后，对机体和内源性组织的正常运转没有影响（聂若男等，2019）。当宿主菌被全部裂解后，噬菌体也会被机体的免疫系统所清除（Kortrlght 等，2019；李虹娇等，2021），即噬菌体随宿主菌的消亡而消亡（曹振辉等，2012），从而表现出无残留的特点。因此，某些国家和地区已经批准了某些噬菌体制剂在临床上的应用。例如，欧洲的某些国家已经使用某些噬菌体制剂用来治疗人类皮肤金黄色葡萄球菌感染（Zhang 等，2015），美国FDA 已经批准李斯特菌噬菌体制剂在芝士和禽产品上作消毒用（Fischetti 等，2005）。

1.3 对环境友好

因为噬菌体具有特异性，只能裂解特定的细菌。所以，噬菌体对自然生物群落中的细菌没有干扰作用（龙门等，2016），对环境中的固有微生物没有破坏作用（曹振辉等，2012）。因此，噬菌体也被认为是有效且安全的生态环境净化用生物制剂（葛展霞等，2018）。基于此，噬菌体的应用范围将进一步得到拓宽。

1.4 可穿透生物被膜，对耐药菌有效

耐药菌对人和动物相关疾病的治疗与防控提出了挑战。生物被膜是赋予细菌耐药性的一个重要原因。而噬菌体可破坏细菌的生物被膜（Phee 等，2013）。噬菌体感染、裂解生物被膜外层的细菌，新形成的噬菌体穿透生物被膜进入生物被膜内层，继续感染内层的细菌，直至裂解完所有细菌（Khalifa 等，2016；杨羽等，2022）。噬菌体产生的解聚酶具有清除生物被膜的能力（Majkowska-Skmbek 等，2018）。噬菌体TSK1 处理培养的肺炎克雷伯菌后可使其生物被膜量降低85% ～100%（Tabassum 等 ，2018）。当噬菌体DM33 感染后，铜绿假单胞菌就失去了形成生物被膜的能力（Zegans 等，2009）。噬菌体可以随细菌的进化而对自身进行修饰，使其具有裂解耐药菌的能力（李虹娇等，2021）。噬菌体在解决耐药菌感染方面具有很好的应用前景（Rehman s 等，2019），被认为是潜在的“超级细菌的有效克星”（葛展霞等，2018）。这个特点是目前人们研究与开发噬菌体的主要“推动力”。

1.5 生产与使用的成本低

生产噬菌体的成本比较低（李帅华等，2020）。制备噬菌体制剂所需的原材料均非常容易获得。噬菌体以指数方式进行增殖，剂量放大效应明显（曹振辉等，2012）。所以，应用时剂量不会很高。同时，不需要反复多次给药（吴立婷等，2022）。因此，使用成本也相应地不会很高。

1.6 剂型与给药途径多样化

可以将噬菌体制成不同的剂型，如清洗液、软膏、粉末、敷料、面霜、雾化剂等（舒飞鸿等，2022）。噬菌体应用有多种给药途径。注射给药途径包括肌肉注射、腹腔注射、静脉注射、皮下注射；局部给药途径包括皮肤局部给药、眼局部给药、耳局部给药、口腔局部给药、鼻腔局部给药或雾化吸入、尿路给药、直肠给药等（舒飞鸿等，2022）。口服给药也是常见的给药途径，但要避免胃酸的影响。其他不常用途径还包括浸浴、喷雾等。针对不同的感染部位以及局部感染或全身感染的差异，可选择不同剂型的噬菌体制剂通过不同给药途径进行应用。这个特点非常有利于噬菌体的具体应用。

1.7 不影响正常菌群

正常菌群对机体的健康具有重要作用。噬菌体不损害生物机体内共存的微生物群落（聂若男等，2019；刘畅等，2022）。噬菌体具有很强的特异性，主要对其靶菌具有裂解作用，但对肠道内的其他正常菌群没有干扰作用（曹振辉等，2012；马艳香等，2012）。这个特点也是噬菌体对人和动物安全的另一个方面。

1.8 来源广泛

噬菌体在自然界中的分布非常广泛，有细菌的地方就会有噬菌体，含量也非常丰富（聂若男等，2019；Brussow 等，2022）。因此，自然界中的噬菌体被认为是可以利用的丰富的抗菌资源库（Wommack 等，2000）。以临床上的目标菌为“钓饵”，可以从多种环境中“钓”（分离）到相应的噬菌体，且分离率较高。例如，从多种食物如碎牛肉、猪肉等肉制品、奶制品、生菜等中分离出许多针对沙门菌的噬菌体（聂若男等，2019）。

2 问题

虽然噬菌体具有较多的优点，但在实际应用时也面临一些问题。

2.1 突变的耐受菌

噬菌体与细菌之间存在着“此消彼长”的演化关系。在演化的过程中，细菌可能发生突变，通过阻止细菌吸附（Chen 等，2017）、流产感染（Hyman 等，2010）、CRISPR-Cas（Rostol 等，2019）等方式对原来有效的噬菌体产生耐受现象，从而使得原来有效的噬菌体变得无效。这是应用噬菌体治疗细菌感染时最常见的问题（林焱等，2022）。虽然噬菌体也会产生新的突变来应对耐受细菌，但需要重新筛选和评估，而这个工作相当繁琐的。

2.2 存在免疫原性

噬菌体有着相对复杂的结构，具有较好的免疫原性，能够诱导人和动物产生较好的体液免疫和细胞免疫。体液免疫应答产生的抗体中存在有抗噬菌体作用的中和抗体，而这种中和抗体是影响噬菌体治疗效果的重要因素之一（王冉等，2019）。

2.3 菌株和毒株的不同导致效果的差异

不同细菌和不同噬菌体因来源不同而有着不同的生物学特性。对于一株给定的噬菌体针对临床中同一种细菌的不同菌株时，其感染能力和抑菌能力会存在差异（Mahmoud 等，2018；林焱等，2022），就可能会出现不同的结果。因此，宽噬菌谱的噬菌体在临床应用时会遇到不同的菌株，从而会表现出裂解效果的差异。同样，针对同一株细菌的不同噬菌体毒株对宿主菌的感染能力和抑菌能力也存在着差异，也可能会出现不同的结果。

2.4 环境中存在灭活噬菌体的理化因素

应用时噬菌体必须是活的。而具体应用时，环境中存在着各种影响噬菌体存活的物理性和化学性因素，如温度、紫外线、有机溶剂、酸碱度（pH）等对噬菌体的裂解效果有着不同程度的影响。噬菌体P65 在30～45 ℃时有较好的裂解活性，在70 ℃时基本失活，在pH 4～10 时裂解活性较稳定，在pH 2 时基本失活，随着紫外线照射时间延长而裂解活性逐渐降低（侯忠余等，2022）。环境中可能存在着保护细菌的物质或抗病毒物质，如脂肪（GILL 等，2006）、乳清蛋白（O'FLAHERTY 等，2005）等，从而影响噬菌体的裂解效果（侯忠余等，2022）。只有能够耐受体内外环境的噬菌体才能走向应用（肖小平等，2021）。

2.5 噬菌谱较窄

噬菌体的噬菌谱（或称宿主谱）一般都较窄，从而表现出特异性强的特点。然而，这也限制了噬菌体的应用。虽然现在有一些研究报道称分离到了对不同种属细菌或对某种细菌的不同血清型菌株或不同种菌株具有裂解作用的噬菌体。例如，炭疽芽孢杆菌噬菌体AP631 还可以不完全裂解部分蜡样芽孢杆菌（张慧娟等，2016）；噬菌体C6 对非致病性大肠杆菌（E.coli 22）和致病性大肠杆菌（包括大肠杆菌O157(E.coli W1)、产志贺毒素大肠杆菌（STEC W3、STEC W5)、肠致病性大肠杆菌（EPEC 143)）具有裂解作用（林焱等，2022）；噬菌体qbNJl4 对来自不同宿主且可致不同症状的14 株肠道内大肠杆菌和13 株肠道外大肠杆菌具有裂解作用（姜珊等，2015）；某些噬菌体可跨属感染细菌，如噬菌体L6jm 可感染猪霍乱沙门菌和产肠毒素大肠杆菌（张玉宇等，2020）；噬菌体LP8 可裂解产单核细胞李氏杆菌和威尔斯李氏杆菌（李天昊等，2022）。虽然可以通过将不同嗜菌谱的噬菌体制成噬菌体鸡尾酒混合制剂来拓宽噬菌谱，但是，这个谱还不够宽。

2.6 可能存在的安全性问题

某些噬菌体的基因组中可能含有耐药基因、毒力因子基因和整合酶基因，从而导致耐药因子的传递。因此，在筛选到一株噬菌体后应进行全基因组测序，仔细分析后判断其安全性。在制备噬菌体制剂时，如果仅简单地通过过滤方法除去宿主菌，收集滤液进行应用，可能会因为裂解后宿主菌的细胞碎片、内毒素、表达的毒力物质、质粒DNA 等导致对使用宿主的安全性问题。因此，应用时应使用精制的纯度高的噬菌体。某些噬菌体在应用到人或动物机体时，有时会出现轻微的或一过性的不适（舒飞鸿等，2022）。也许对于某些免疫力极低人员或极个别不同体质的人或动物可能是不适合使用噬菌体的。某些裂解性噬菌体可向溶原性噬菌体转变，进而会改变宿主菌的毒力和致病性。

3 对策

解决上述这些问题，对加快噬菌体的开发与临床应用具有重要意义。

3.1 混合、联用，开发噬菌体源物质，应对耐受菌

存在对噬菌体耐受的细菌是影响噬菌体应用的一个重要因素。噬菌体鸡尾酒制剂是几种不同的噬菌体混合制成的制剂。当耐受菌对其中的某种噬菌体产生耐受，但对另一种噬菌体不一定也产生耐受，从而可以延长制剂的使用时间。噬菌体联合抗生素进行使用，可以降低噬菌体和抗生素的使用剂量，降低细菌对噬菌体和抗生素形成耐受性的概率。噬菌体复制时产生的溶菌酶、解聚酶、内溶素等对突变的耐受菌仍有较好的抗菌活性。噬菌体来源的内溶素稳定性高，细菌对其没有耐受性，将可能成为替代噬菌体的新选择（舒飞鸿等，2022）。

3.2 通过化学与基因工程方法，避开免疫原性的影响

因免疫原性而诱导机体产生的抗体可能加快噬菌体的清除，从而影响噬菌体的使用效果。选择低免疫原性的噬菌体可以避免适应性免疫应答，或者通过化学修饰来降低噬菌体的免疫原性，延长噬菌体在体内的半衰期，或者将噬菌体进行包被以规避中和抗体的作用，或者通过生物技术去除噬菌体上赋予免疫原性的蛋白，从而提高噬菌体的治疗效果（王冉等，2019）。

3.3 因“株”设案，达其最大功效

噬菌体的毒株不同，使用效果会不同。在筛选噬菌体时，要将具体某株噬菌体的生物学特性充分了解清楚，然后根据这些特性设计具体的使用方案，才能达到相应效果。

3.4 提高稳定性，确保噬菌体活着

只有活的噬菌体才能发挥相应的裂解功能。因此，要通过各种方法来确保噬菌体活着。通过多方筛选或通过基因工程方法改造以获得高环境稳定性的噬菌体，或者对噬菌体进行包被技术处理如微囊化以提高噬菌体的存活率。

3.5 拓宽噬菌谱，扩大应用范围

宽谱噬菌体具有重要的应用价值（许方方等，2021）。如能像抗生素那样具有较宽泛的抗菌谱，噬菌体将得到更广泛的应用。将针对不同菌的噬菌体表面的反受体通过基因工程方法展示在同一种噬菌体上，可扩大噬菌体的嗜菌谱。在实验室条件下，将噬菌体A 与菌B 共培养使其发生共演化，筛选后获得可裂解菌A 和菌B 的噬菌体AB，将噬菌体AB 再与菌C 共培养使其发生共演化，筛选后获得可裂解菌A、菌B 和菌C 的噬菌体ABC，如此循环进行“共演化-筛选”过程，将可能获得宽嗜菌谱的噬菌体。

3.6 多点多面检测噬菌体及其制剂，确保安全

噬菌体对人和动物的安全性直接决定了其临床应用价值。在分析完噬菌体的溶原/裂解性能后，对裂解性噬菌体可先进行全基因组测序，分析其携带毒力因子和耐药基因等情况，再对安全的裂解性噬菌体进行精制。可借鉴动物病毒的纯化方法来纯化噬菌体（梁莉等，2010）。总之，在筛选可应用的噬菌体时应注意多方面的检测与分析，最终选择对人和动物安全的噬菌体。

4 展望

噬菌体在细菌性疾病治疗与预防领域的应用潜力巨大，值得深入开发与研究。虽然已经有部分噬菌体制剂在生产实践中进行应用，但是还有许多工作需要进一步完善。（1）我国关于噬菌体产品生产和制造的标准和相关法规还相当少，需建立完善的噬菌体应用安全评价体系以保证噬菌体生产应用中每个环节的安全性。（2）在国家层面上加大对噬菌体治疗的基础研究投入，建设全国性甚至世界性的噬菌体库，并进行资源共享，提升噬菌体治疗的价值。（3）“噬菌体+X（抗生素、抗菌肽、中药制剂、疫苗、微生态制剂、后生元等）”的联合使用可以拓宽噬菌体的应用范围，是值得深入开发研究的方向。（4）利用噬菌体展示技术开发新型噬菌体，以提高稳定性或和拓宽嗜菌谱。（5）革兰阴性的宿主菌被裂解后释放的内毒素可能对人和动物机体产生负面作用，如何规避这一问题，同时确保噬菌体的裂解活性，目前还需深入研究。

参考文献：（略）