纳米氧化锌抑制柔嫩艾美耳球虫感染的作用研究

郑淑媚,田启明,许书雅,彭伟龙,Hosameldeen,刘明江,伯若楠,李金贵* (1.扬州大学兽医学院,江苏 扬州225009;2.江苏省动物重要疫病与人畜共患病防控协同创新中心,江苏 扬州225009)

鸡球虫病是严重危害养殖行业的疾病之一,该病首次发现于1674年,是由艾美耳属球虫引起的鸡原虫病[1]。临床上鸡球虫病主要表现出腹泻、生产性能和体质量下降等症状,并伴随不同程度的肠道损伤,给养殖业造成巨大的经济损失。尽管采用轮换用药等方法,但由于耐药性等问题,雏鸡球虫病仍时有发生。因此,寻找潜在的替代药物具有重要的实际意义。

纳米氧化锌不仅具有较高的催化性、吸附性和药物利用率,更表现出较好的抗氧化、抗肿瘤和抑菌等生物活性[2]。因此,纳米氧化锌在食品、化学、医疗等方面已被广泛应用。在观察纳米氧化锌作用蠕虫虫体的扫描电镜发现蠕虫虫体损伤,表面乳头断裂,运动能力随作用时间丧失明显,可见其对寄生虫具有对抗能力[3]。但是,目前关于纳米氧化锌对鸡球虫病的研究较为罕见。因此,本试验以E.tenella感染雏鸡来探讨其对球虫病的预防作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物180只1日龄黄羽肉鸡购自中国农业科学院家禽研究所,饲养于经氨水喷洒和甲醛熏蒸消毒的动物房;不含抗球虫药的全价雏鸡饲料购于中国农业科学院家禽研究所;整个饲养过程按照标准的饲养程序饲养至13日龄,试验开始前2 d采用饱和盐水漂浮法镜检鸡粪中无球虫卵囊。

1.2 药物与试剂纳米氧化锌购自上海麦克林生化科技技术有限公司(Z820774,99.8%,50±10);地克珠利溶液购自天津市保灵动物保健品有限公司(批号20181003);RNA试剂购自南京诺维赞生物有限公司;ELISA试剂盒(TGF-β、GM-CSF、sIgA、IgM、IgG)购自上海哈灵生物有限公司。

1.3 试验仪器AXIOVERT A1 倒置荧光显微镜(Carl Zeiss,德国);7500 Fast 实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems,美国);EPOCH 核酸蛋白浓度检测仪(Biotek,德国);SM-650A超声破碎仪(南京舜玛,中国);BSA223S-CW 电子天平(Sartorius,德国)。

1.4 试验虫株柔嫩艾美耳球虫卵囊由扬州大学中兽医教研室保存,经雏鸡接种纯化后获得孢子化卵囊。在正式试验开始前,按照黄兵等[4]所述的方法,对虫株进行笼饲试验,在地克珠利作用下计算病变计分减少率(RLS)、相对卵囊产量(ROP)、最适抗球虫活性百分率(POAA)、抗球虫指数(ACI),表明该虫株对地克珠利轻度耐药。

1.5 方法

1.5.1纳米氧化锌颗粒悬浮液的制备 按照文献方法制备[5],称取相应浓度的纳米氧化锌粉末置于蒸馏水中,超声(60 Hz,15 min)以形成均匀的悬浮液,每次使用前振荡混匀。

1.5.2试验动物的分组与处理 180只13日龄黄羽肉鸡随机分为6组,每组3个重复,每个重复10只,分别是空白组(Con)、模型组(Mod)、纳米氧化锌低剂量组(ZNP-10)、纳米氧化锌高剂量组(ZNP-20)、地克珠利组(Dic)和纳米氧化锌药物对照组(Dcp)。13日龄起,除Con和Mod组给予1 mL/只的生理盐水,ZNP-10组、ZNP-20和Dcp组分别口服药量为10,20和20 mg/kg(1 mL/只)的ZNP悬液,Dic组自由饮水给药(1 mg/kg),连续给药8 d。于15日龄人工感染球虫,除Con和Dcp组外,感染组的每只鸡经口接种6×104个孢子化卵囊(1 mL/只)。试验期间,观察临床症状及血便情况,于23日龄进行盲肠病变计分及样本收集。

1.5.3临床症状观察、血便计分和卵囊计数 攻虫后,每天观察雏鸡的精神状况和存活率,公式为:存活率(%)=(存活雏鸡数/总数)×100%

开始出现血便后,参照文献方法进行血便计分,并开始卵囊计数,计算克粪便卵囊数(oocysts per gram,OPG)[6-7],球虫卵囊数值=(各组卵囊总数/4)×104×稀释倍数。

1.5.4盲肠病变计分、相对增重率和抗球虫指数 盲肠病变计分参照文献[8]的方法进行,盲肠病变值=各组的病变记分总和/各组的雏鸡总数×10。相对增重率(relative weight gain rate,RWG,%)=各组的平均体质量/空白组的平均体质量×100%。

根据相对增重率、存活率、病变值、卵囊值计算ACI(anticoccidial index,ACI),ACI=(存活率+相对增重率)-(盲肠病变值+球虫卵囊数)。评判标准如下:ACI<120,无效;ACI在120～160范围内,低效;ACI在160～180范围内,中效;ACI≥180,高效。

1.5.5病理组织学观察 分离的盲肠在4%甲醛固定24 h后,进行梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后用于HE染色,镜检盲肠组织的病理学变化。

1.5.6免疫器官指数的计算 试验结束后,称取各组雏鸡体质量,解剖取出内脏,分别称取法氏囊和脾脏的重量,最后按照公式进行计算,免疫器官指数(%)=(免疫器官质量/体质量)×100%。

1.5.7RT-qPCR检测基因IL-1β、TNF-α及18sRNA的表达 用Trizol法提取总RNA[9],按照荧光定量PCR按照说明书预混20 μL RT-qPCR反应体系:10 μL Hieff®qPCR SYBR green master mix,2 μL forward primer,2 μL reverse primer,6 μL稀释的cDNA。反应体系如下:95℃ 5 min,95℃ 10 s,60℃ 30 s,循环40次。以18s RNA为内参基因,使用2-ΔΔCt法对Ct值进行相对定量分析。IL-1β、TNF-α及18sRNA的引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR分析的基因引物序列

1.5.8盲肠扁桃体中检测GM-CSF、TGF-β和免疫球蛋白的表达 取盲肠扁桃体样本的组织匀浆检测TGF-β、GM-CSF、sIgA、IgM、IgG的表达,具体操作方法参照ELISA试剂盒说明书。

1.6 统计分析数据分析使用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8.0 对各组数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA),结果以平均值±标准差表示,P<0.05视为差异显著,P<0.01视为差异极显著。

2 结果

2.1 不同处理组雏鸡的临床表现相较于Con组,Mod组在攻球虫72 h后羽毛蓬乱,扎堆状况明显;120 h后开始出现较多血便和深色粪便,并出现死亡,相对增重下降最明显。与Mod组相比, ZNP-20组大部分雏鸡精神状态良好,血便情况缓解,深色粪便出现频率降低, Dic组攻虫后精神状态较好,ZNP-10组临床症状较模型组略有好转,但是总体上无明显效果。与Con相比,Mod组差异极显著(P<0.01),试验中Mod组死亡1只,96 h后发育缓慢甚至停滞;与Mod组相比,ZNP-10组死亡2只,但其相对增重处于上升趋势;而ZNP-20与Mod组差异极显著(P<0.01),ZNP-20组无死亡雏鸡,同时在球虫感染期间未影响其增重。各组存活率、相对增重和血便情况如表2、图1。

表2 球虫感染后不同时间血便计分

图1 不同处理组鸡的相对增重和存活率

2.2 盲肠病变及计分、卵囊值变化以及抗球虫效果比较Con组盲肠颜色长度和肠壁正常,肠内容物柔软,无眼观病变;Mod组盲肠明显缩短,肿大,触之坚硬,剪开后有肠栓和恶臭,有凝固的血液,含大量卵囊;ZNP-10可见明显盲肠缩短肿胀;ZNP-20组盲肠长度虽较Con短,但未见明显肿大,触之柔软,卵囊数明显减少;Dic组与ZNP-20组相似(图2)。盲肠病变计分、卵囊数见表3,4。

表3 盲肠病变计分及病变值(n=10)

A.Con组;B.Mod组;C.ZNP-10组;D.ZNP-20组;E.Dic组;F.Dcp组

抗球虫指数如表5所示,Mod组为77,ZNP-10组为102,ZNP-20组159,Dic组165。因此,ZNP-20组具有良好的抗球虫指数。

表4 球虫感染后120,144,168 h粪便卵囊计数 个

表5 各试验组的抗球虫指数

2.3 盲肠病理组织学变化各组盲肠组织切片如图3所示。Mod组盲肠组织固有层变薄,黏膜膜层组织损伤,黏膜出血、水肿伴有大量炎性细胞浸润,上皮细胞及盲肠内容物内可见大量虫体。纳米氧化锌预防组可见黏膜下层毛细血管充血,肠腺细胞间隙间出血,但相较于Mod组,固有层较厚且肠绒毛结构完整。

A.Con组;B.Mod组;C.ZNP-10组;D.ZNP-20组;E.Dic组;F.Dcp组;黑色箭头.为球虫虫体;红色箭头.为炎性细胞

2.4 ZNP对球虫感染后雏鸡免疫水平的影响

2.4.1免疫器官指数的变化 脾脏和法氏囊作为禽类最重要的免疫器官,是反映机体的免疫水平的重要指标。与Con组相比,Mod组的脾脏和法氏囊指数显著高于空白组(P<0.001),可见球虫感染后,雏鸡的脾脏和法氏囊过度增重,说明球虫感染后可引起免疫器官炎性过度增生,体积增大。ZNP用药组免疫器官指数下降且与Mod差异显著(图4),说明口服ZNP后,能抑制雏鸡免疫器官的过度增生。

*为与Con组比,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;#为与Mod组比,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001。下同

2.4.2盲肠扁桃体炎性因子mRNA和蛋白表达变化 与Con组相比,Mod组在感染球虫192 h后,盲肠扁桃体中IL-1β、TNF-α的mRNA表达水平高(图5 A)以及较高(图5 B),说明球虫感染后可以促进炎性因子IL-1β、TNF-α的合成和分泌,进而引发炎症反应,经治疗后,与Mod相比,20 mg/kg ZNP显著下调了IL-1β和TNF-α的mRNA表达水平(P<0.001),可见20 mg/kg ZNP治疗后可以抑制促炎因子的分泌。同时,病雏口服20 mg/kg ZNP后显著上调了GM-CSF和TGF-β的蛋白表达量(P<0.01,P<0.001),进而缓解机体炎症,减轻肠道损伤。

图5 盲肠扁桃体中IL-1β、TNF-α、GM-CSF、TGF-β的表达情况(n=10)

2.4.3盲肠扁桃体中免疫球蛋白的表达 禽类肠道中的免疫球蛋白可以与抗原发生结合等反应,进而限制病原微生物等进入肠道。在本试验中,与Con组相比,Mod组sIgA、IgG、IgM的表达量显著升高(P<0.001);ZNP-10组和ZNP-20组中sIgA、IgG、IgM的表达量则比Mod组进一步升高(图6),且与Mod组有显著差异(P<0.001),说明球虫感染后,ZNP可以提高盲肠扁桃体中免疫球蛋白的表达,增强肠道的免疫力,同时Dcp组中sIgA、IgG表达量与Con组相比有差异(P<0.05),可见20 mg/kg ZNP可以使健康肠道处于免疫激活状态,进而抵御抵御病原体。

图6 盲肠扁桃体sIgA、IgG、IgM的表达(n=10)

3 讨论

鸡球虫病是艾美耳属原虫侵害宿主肠上皮,而引起的具有致死性的急性肠道寄生虫病,因其传播范围广、感染率高,养殖场需要花费数百万美元来控制[10]。同时,目前抗球虫药耐药机制的研究已逐步深入[11],但仍然无法解决耐药性的问题。因此,寻求一种新型抗球虫药仍是现在研究球虫病的重点之一。

锌是动物机体的必需元素,有提高机体免疫力、抗氧化能力等作用。研究表明,纳米氧化锌颗粒是最好的锌源,能广泛分布于动物机体内,吸收利用率高,甚至能避开与其他药物的不良反应,并且美国食品药品监督管理局(FDA)列入被认定为安全的物质中[2]。有研究表明,ZNP改善鼠感染球虫后引起的杯状细胞减少,同时可以减少卵囊排出[5]。口服感染1×104堆型艾美耳球虫的雏鸡经20 mg/kg 纳米氧化锌治疗后,可以提高存活率,减轻肠道损伤,其ACI可达180。

本试验使用柔嫩艾美耳球虫敏感虫株感染雏鸡,Mod组出现了体质量下降、精神不振、明显的血便、肠栓以及盲肠组织损伤严重等症状,ZNP-20明显缓解了因球虫感染引起的体质量下降、血便情况等症状,存活率为100%;且ACI达159,接近中等抗球虫药效。

球虫感染机体后,主要寄生于雏鸡盲肠,盲肠扁桃体是肠道最大的免疫器官,因此能精确地反应盲肠抗球虫感染的变化。IL-1β作为促炎因子会募集免疫细胞趋化至病变部位,引起超联反应,从而放大炎症反应。在弓形虫诱发的鼠癫痫模型中,抑制IL-1β可以显著降低癫痫发作频率[13]。有研究指出,在鼠细小梭菌感染的模型中,壳聚糖降低了促炎因子TNF-α的表达,重塑肠道微生物菌群[14-15]。GM-CSF主要作为集落刺激因子参与体液免疫,能促使淋巴细胞向球虫寄生部位聚集,进而发挥抗球虫作用[16-17]。有文献表明TGF-β是一类多肽类细胞因子,具有抑制肠道炎症、修复肠黏膜的功能[18]。试验结果发现,20 mg/kg ZnO可以显著降低免疫器官指数,抑制了球虫感染引起的免疫器官炎性增生,减少促炎因子IL-1β和TNF-α的表达,缓解球虫感染对机体的刺激;与此同时,TGF-β和GM-CSF表达的增多协助机体减轻炎症水平,缓解肠道损伤。

黏膜免疫是机体抵御感染的重要环节,其表面有着重要的免疫组织结构和功能,其中sIgA、IgM、IgG在各种免疫调节中发挥重要的作用。有研究表明,球虫刺激会使黏膜分泌大量分泌型免疫球蛋白(sIgA),由此阻止寄生虫入侵定殖黏膜[19];YUN 等[20]研究发现感染艾美耳球虫后,肠道中特异性IgM、IgG抗体水平显著升高。与文献一致,本试验发现感染球虫192 h后,Mod组的sIgA、IgM、IgG的含量均上调。同时,三者的含量在ZNP-20组中的表达较Mod组显著升高,说明增强了盲肠局部黏膜免疫功能。与研究结果相一致,GUO等[21]在研究香菇多糖对艾美耳球虫感染肉鸡后能进一步增强sIgA、IgG和IgM特异性抗体水平,从而介导宿主对鸡球虫病的免疫反应。

综上所述,20 mg/kg ZNP具有中等抗球虫作用,在一定程度上改善球虫感染引起的肠道损伤及增重缓慢的现象。同时可以缓解免疫器官炎性增生,抑制炎性因子IL-1β和TNF-α的表达,并提高TGF-β、GM-CSF的表达水平,以此来减轻肠道炎症,同时能使免疫球蛋白sIgA、IgM、IgG的表达量增多,增强黏膜免疫功能。