猪圆环病毒4型实时荧光RAA检测方法的建立

陈伟月,吕 荞,,李玉莹,于子萍,黄海鑫,汪 伟,刘宇梦,孙文超*,郑 敏* (.温州大学 病毒学研究所,浙江 温州 35035;.广西动物疫病预防控制中心,广西 南宁 530004)

猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)为单链DNA病毒,是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属(Circovirus)成员。目前,全球报道过的猪圆环病毒有4种:PCV1、PCV2、PCV3和PCV4[1-4]。PCV4于2019年首次在中国湖南发现,随后在中国河北、江苏、河南、山西、广西等多地以及韩国也出现PCV4相关的报道,阳性率为1.27%～25.40%不等[5-10]。FRANZO等[11]收集108份西班牙样本,163份意大利样本,均未检测出PCV4。以上报道显示,PCV4已经流行于亚洲,但欧洲还没有PCV4存在的证据。

PCV4基因组包含两个主要的开放阅读框,ORF1和ORF2,分别编码复制酶蛋白(replication associated protein,Rep)和衣壳蛋白(capsid protein,Cap)。研究表明,在当前流行的PCV4毒株基因组和蛋白质结构相对稳定,与水貂圆环病毒(mink circovirus,MiCV)的同源性最高(61%～81%)[12-13]。2020年,国际病毒分类委员会(International committee on the taxonomy of viruses,ICTV)根据全基因组成对序列同一性80%为物种划分阈值的指导原则和分子系统发育分析结果将PCV4分类为圆环病毒属中的一个新的物种[14]。研究表明,PCV4感染可能与呼吸系统病症、神经系统病症、腹泻、繁殖障碍等多种临床症状相关,并且可感染不同年龄段猪[4,8,10]。NIU等[13]从感染性克隆中获得拯救病毒PCV4,拯救病毒在PK-15细胞和仔猪中是可复制的,且对仔猪具有致病性。然而,PCV4迄今尚未从临床样本中分离出来,其致病机理尚不明确,对养猪业存在潜在威胁,为防止其蔓延,需要建立高效的PCV4检测方法。

RAA在37～42℃的温度条件即可完成核酸的快速扩增,整个反应时长只需15～30 min[15-16]。荧光RAA可通过荧光探针对检测结果进行实时观察,反应起始由引物-重组酶聚合体对模板DNA解链,单链结合蛋白稳定单链,最后由DNA聚合酶协助链的延伸,延伸至探针时,探针水解,荧光发射基团远离淬灭基团,荧光信号增强反映出扩增产物的积累[15]。本研究基于PCV4Cap基因保守序列设计PCV4 RAA特异性引物和荧光探针,建立PCV4实时荧光RAA检测方法,旨在为PCV4临床检测提供更加快捷简便的技术手段。

1 材料与方法

1.1 病毒核酸与样品PCV2、PCV3、PEDV、PRRSV、TGEV等病毒核酸由本实验室保存;猪组织样品由广西动物疫病预防控制中心采集,-80℃保存。

1.2 主要试剂与仪器基因组DNA提取试剂盒为TIANGEN公司产品;pMD18-T克隆载体试剂盒为TaKaRa公司产品;Trans1-T1化学感受态细胞为TransGen Biotech公司产品;引物和探针由Sangon Biotech公司合成;荧光型RAA试剂盒为南宁壮博生物科技有限公司产品;恒温核酸扩增荧光检测仪(F1620)为江苏奇天基因生物科技有限公司产品。

1.3 重组质粒标准品的构建根据PCV4-Cap基因序列设计1对引物(PCV4-Cap-DF/DR),以PCV4 DNA序列为模板进行PCR扩增,预期扩增产物大小为687 bp。将纯化的产物与pMD18-T载体连接,重组质粒经测序鉴定正确,命名为PCV4-Cap。通过分光光度计测定浓度并通过公式:拷贝数(拷贝/μL)=[6.02×1023×质量浓度(mg/L)×10-9]/(片段长度×660)计算其拷贝数,拷贝数为7.42×1010拷贝/μL,将其作为荧光RAA的标准品。

1.4 核酸的提取所有样品核酸提取过程均按照提取试剂盒说明书步骤进行并于-80℃保存备用。

1.5 引物及探针的设计与筛选从NCBI下载PCV4参考基因序列(MK986820、MT882412、MT882411、MT311853、MT311852、MK986820等)并利用DNAMAN进行多序列比对,选择Cap基因保守区域(图1),利用Primer Premier 5.0设计引物和探针(表1)。先设计探针后设计引物,分别在探针5′端第32个碱基及3′端第16个碱基标记荧光报告基团FAM和荧光淬灭基团BHQ,2种基团之间标记dSpacer (四氢呋喃,THF)。比较不同引物对的出峰时间与荧光信号强度,选择最佳引物对。

表1 PCV4实时荧光RAA特异性引物和探针

图1 引物及探针所在Cap基因保守区域

1.6 实时荧光RAA反应体系优化按RAA试剂盒说明书依次加入各种试剂及模板,混合均匀后离心于检测仪检测荧光值。引物及探针浓度均为10 μmol/L,以7.42×104拷贝/μL的PCV4-Cap重组质粒为模板在37,39,42℃下反应20 min,根据出峰时间和荧光信号强度确定最适反应温度。

1.7 特异性试验利用上述所建立的实时荧光RAA技术,检测PCV2、 PCV3、PEDV、PRRSV及TGEV的病毒核酸,以PCV4病毒核酸为阳性对照,以无核酸酶水为模板作为阴性对照,评估该方法的特异性。

1.8 灵敏度试验将构建的PCV4-Cap重组质粒使用无核酸酶水进行10倍倍比稀释,选择7.42×106～7.42×100拷贝/μL的质粒标准品各1 μL为模板进行RAA扩增,以无核酸酶水为模板作为阴性对照,分析方法的灵敏度。

1.9 样品的检测通过上述建立的PCV4实时荧光RAA方法检测40份猪组织样品,同时用常规的PCR方法进行检测,并用质粒标准品测试普通PCR的灵敏度,比较2种方法的检测结果和灵敏度。

2 结果

2.1 引物的筛选选择7.42×104拷贝/μL的PCV4-Cap重组质粒作为扩增的模板进行实时荧光RAA反应,基于荧光信号呈对数增长的起始时间选择最佳引物对,结果如图2所示,选择PCV4-Cap-F3R2进行扩增后,荧光信号峰值较高,且斜率达到阈值的起始时间最早,因此选择PCV4-Cap-F3R2作为最佳引物对用于后续试验。

1.PCV4-Cap-F3R2;2.PCV4-Cap-F2R2;3.PCV4-Cap-F3R1;4.PCV4-Cap-F2R1;5.PCV4-Cap-F1R2;6.PCV4-Cap-F1R1;7～12.阴性对照

2.2 反应体系的优化以7.42×104拷贝/μL的重组质粒为模板对反应温度(37,39,42℃)进行优化,结果如图3所示,在3种反应温度的条件下,扩增完成后荧光信号峰值相差不大,但是反应温度为42℃时,荧光曲线起峰最快,因此选择42℃作为后续试验的反应条件。

1.42℃;2.39℃;3.37℃

2.3 特异性试验在相同条件下,以PCV4、PCV2、PCV3、PEDV、PRRSV、TGEV等病毒核酸和无核酸酶水为模板进行RAA反应,结果如图4所示,PCV4病毒核酸在5 min内即出现明显荧光信号,而其他病毒核酸和无核酸酶水均为阴性,表明该方法特异性良好。

1.PCV4;2.阴性;3～6.PCV2、PCV3、PEDV、PRRSV、TGEV

2.4 灵敏度试验以不同浓度的重组质粒为模板检测本研究建立的实时荧光RAA方法的灵敏度,结果如图5所示,随着拷贝数的降低,出峰时间逐渐延长,而阴性对照荧光信号无明显变化,表明最低检出限为7.42×101拷贝/μL,且在10 min之内出现明显的扩增趋势,表明该方法具有较高的灵敏度。

1～7.106～100PCV4-Cap;8.阴性对照

2.5 临床样品的检测结果如图6所示,常规PCR对PCV4的检出限可达到7.42×102拷贝/μL,RAA检测方法灵敏度比常规PCR高10倍。利用RAA和常规PCR两种检测方法对40份临床样本进行检测,均未检测到PCV4阳性样本。

M.DL2000 DNA Marker;1～7.PCV4-Cap浓度依次为106,105,104,103,102,101,100拷贝/μL;8.阴性对照

3 讨论

PCV4作为一种新型圆环病毒,其致病性和流行趋势尚不明确,对其紧密监测有助于防止进一步蔓延。GE等[17]在对PCV4抗体的检测中,从2008年的样本中检测到了PCV4,表明该病毒在猪群中的存在比发现的更早。PCV4在基因组水平上与其他PCV和BtCV相比更接近MiCV,暗示PCV4与MiCV具有共同进化祖先,可能对猪以外其他动物的健康构成巨大威胁。建立一种PCV4的快速检测方法有助于PCV4的流行病学调查和传播控制。

目前,对于PCV4病原体的检测,应用的方法有普通PCR法、实时荧光PCR法、酶联免疫吸附法、环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)法[18-20]。黄小武和ZHANG等[21-22]分别根据PCV4 Rep和Cap基因建立了SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法,检测下限分别为5.64×102,3.00×101拷贝/μL;张倩等[23]根据PCV4 ORF2序列建立了Taqman探针法,检测下限达到1.53×101拷贝/μL。KIM等[24]开发了一种LAMP测定法,使用羟基萘酚蓝(HNB)金属指示剂对PCV4 DNA进行检测,可以在64℃下40 min内完成对PCV4的测定。除此之外,GE和LIAN等[17,25]分别基于Rep和Cap建立了间接酶联免疫吸附法检测PCV4。上述方法中,常规PCR方法流程复杂;荧光定量PCR仪器设备的要求较高且耗时久;LAMP测定法的引物设计复杂,需要设计多对引物,引物之间错配概率高,容易产生假阳性结果;ELISA检测方法依赖于抗原-抗体结合,采样困难,对操作人员要求较高,不适于病毒感染早期的诊断。

RAA技术避免了PCR方法中温度反复升降带来的弊端,操作简单,对仪器设备要求低,只需设计1对引物,弥补了上述方法的不足。RAA技术还可以与CRISPR-Cas13a检测法、测流层析试纸条检测法、琼脂糖凝胶电泳检测法和实时荧光检测法等多种检测技术结合,进而更直观地观察到检测结果。实时荧光RAA可以在20 min内完成检测,可实时观察反应进程,极大地提高了检测效率。RAA技术是一种新型的检测技术,最早在2010年出现了相关的报道[26]。2016年,郑伟等[27]建立了黄热病毒RT-RAA方法,随后越来越多的病原体RAA检测方法建立起来。目前,在对于猪圆环病毒的RAA检测中,吴江等[28]于2021年建立了PCV3的RAA检测方法,最低检出限为102拷贝/μL,从115份临床样品中检出阳性样本26份。本研究建立的PCV4实时荧光RAA检测方法,可在42℃下20 min内完成检测,灵敏度高,检出限可达到7.42×101拷贝/μL。该方法特异性强,与常见的几种猪源性病毒核酸不发生反应。实际检测中,RAA和PCR两种方法均未检出PCV4,暗示当前猪群中PCV4的感染率较低。综上所述,本研究所建立RAA检测方法可为PCV4的快速检测提供一种新的技术手段,对基层养殖场PCV4的排查有重要意义。