血凝素的糖基化模式对G57基因型H9N2亚型禽流感病毒的稳定性和受体亲和性影响

韩金宏,孙艺学,朱艳婷,丛彦龙* (.吉林大学 动物医学学院,吉林 长春 30062;2.长春大学 吉林省生物医学工程研发中心,吉林 长春 30022)

H9N2亚型禽流感在我国已有30年的流行历史,临床上以感染率高,隐蔽性强,分布广泛,危害持久为特点。在试验环境下,H9N2亚型禽流感虽然表现为低发病率和死亡率,但是在临床上却可以出现中等致病表型,甚至高达60%的死亡率,所造成的损失仅次于高致病性禽流感[1-2]。作为人兽共患传染病的病原体,H9N2病毒持续威胁着公众安全,感染者以无症或轻症为主[3]。基因重排现象在H9N2亚型内部十分普遍,这不仅极大地促进了它的适应性传播,也为一些更具公共卫生威胁的H5、H7、H10等亚型流感病毒获得H9N2病毒的内部基因提供了先决条件。

研究显示,流行于我国禽群中的不同进化分支的H9N2病毒的适应性存在明显差异,而且随着时间的推移,毒株的流行优势也发生了更迭,病毒的种类越来越趋于单一化,出现了具有明显流行优势的G57基因型病毒[4]。然而,关于G57基因型病毒的适应性和流行优势的分子机制等科学问题尚未得到充分的科学评估。作为免疫压力的主要靶点,HA基因在进化过程中获得了糖基化修饰的能力[5],糖链对抗原表位的遮蔽或修饰成为流感病毒逃逸免疫压力的一种重要进化优势。鉴于HA基因在流感病毒感染中的重要作用,以其糖基化模式所呈现的基因多态性作为研究对象,从病毒的增殖能力、稳定性和受体亲和性等角度开展体外研究,以期揭示不同HA糖基化模式影响H9N2病毒适应性的分子基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞、载体A/WSN/1933(H1N1)(简称WSN)、293T细胞(ATCC®CRL-11268)、MDCK细胞(ATCC©CCL34)、CEF细胞、反向遗传载体pHW2000载体由实验室保存。

1.2 主要材料T4DNA连接酶购自Promega公司;DNA Marker、M-MLV Reverse Transcriptase、La Taq DNA Polymerase购自TaKaRa公司;Tripure Isolation Reagent购自Roche公司;DMEM High Glucose购自Gibco公司;Fetal Bovine Serum(FBS)购自BI公司;InvitrogenTMLipofectamine 3000、TPCK-Treated胰蛋白酶、受体破坏酶(RDE)、霍乱弧菌神经氨酸酶购自Sigma公司。Neu5Acα2,3Galβ1,4GlcNAc-SpNH-PAA-biotin(3′SLN)和Neu5Acα2,6Galβ1,4GlcNAc-SpNH-PAA-biotin(6′SLN)由Consortium for Functional Glycomics提供。

1.3 质粒构建与病毒拯救通过反向遗传操作进行流感病毒拯救[6]。以基因合成的G57基因型H9N2病毒的HA基因(GISAID号:EPIISL 330737)为基础,通过定点突变构建5种HA糖基化模式,并将这些HA基因片段分别与pHW2000连接。将构建成功的流感病毒8个质粒按RNA聚合酶各0.6 μg,其余0.5 μg剂量与Lipofectamine 3000混合后转染293T细胞,于37℃、5% CO2培养箱中培养,24 h后补加2 mg/L的TPCK胰酶。收取293T细胞上清接种至MDCK细胞,2 h后补加TPCK胰酶,接毒72 h后收取MDCK细胞上清并测定HA血凝效价。将拯救的5种不同HA糖基化模式病毒分别命名为reHA7、reHA6、reHA5、reHA4、reHA3,并将其HA基因送至公司测序。随后将已拯救出的病毒接种至9～11日龄SPF鸡胚增殖并纯化。

1.4 病毒生长动力学曲线将CEF细胞铺于96孔细胞培养板。以10倍梯度稀释病毒,每个稀释度设置5个复孔进行TCID50测定。根据Reed-Muench法计算病毒的TCID50,并换算出相应的MOI。将病毒以MOI=0.1或MOI=0.01感染CEF细胞,分别收取感染后12 h内每隔2 h和72 h内每隔12 h的细胞上清,测定不同时间点病毒的TCID50。

1.5 pH值稳定性测定为了比较不同HA糖基化模式病毒在不同pH值条件下的稳定性,将128HAU的50 μL病毒与等体积的100 mmol/L醋酸盐缓冲液(pH 4.0和5.0)、100 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.0)或100 mmol/L中性磷酸盐缓冲液(pH 7.0)混合。在37℃下孵育10 min后,通过血凝试验测定病毒的血凝滴度变化。

1.6 热稳定性测定为了比较不同HA糖基化模式病毒在不同温度条件下的稳定性,将128HAU的50 μL病毒分别在50℃或56℃下孵育0,5,10,15,30 min及1,2,3,4 h。随后,将热处理的病毒样品快速冷却至4℃,并进行1式3份的血凝试验,以确定病毒的血凝滴度变化。

1.7 红细胞洗脱试验由于不同HA糖基化模式病毒的NA基因片段相同,因此可以通过红细胞(red blood cell,RBC)洗脱试验检测它们与RBC结合后,再释放RBC的时间,以此间接反映病毒与RBC的结合能力。将128HAU病毒2倍倍比稀释,与等体积0.5%鸡RBC在96孔血凝板中混合后置于4℃孵育1 h。然后,将血凝板置于37℃,每隔30 min记录1次HA滴度,持续记录6 h。分别以37℃孵育时间为横坐标,HA滴度为纵坐标绘制RBC解离曲线,以此比较不同HA糖基化模式病毒与RBC的结合能力。

1.8 红细胞凝集试验受体亲和性测定根据PEACKO等[7]所述的方案进行。简言之,将1%的鸡RBC在37℃下用2倍系列稀释的RDE处理1 h,以去除唾液酸。随后,将RBC洗涤3次并制备成1%悬液。然后,将50 μL经RDE处理的RBC与等量的4HAU病毒在冰上孵育45 min,记录使RBC发生完全凝集的RDE的最高稀释度。

1.9 抗血清的制备对3周龄SPF白来航鸡(北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)免疫0.5 mL 0.1%多聚甲醛灭活的病毒。接种后第21天,将收集的血清于56℃灭活30 min,并于37℃以RDE预处理过夜,以去除非特异性抑制剂。将收集的血清保存于-20℃。

1.10 固相结合试验于96孔酶标板中加入100 μL病毒液,4℃包被过夜后,加入初始浓度为0.075 μmol/L的倍比稀释的糖链,4℃作用1 h后加入制备的多抗鸡血清,1 h后加入HRP-兔抗鸡二抗,4℃作用1 h后加入TMB底物,室温避光作用30 min后加入0.2 mol/L的H2SO4,于酶标仪上读取D450 nm值。

1.11 差异统计分析利用GraphPad Prism 7.0软件,采用One-Way或Two-Way ANOVA法进行数据分析,计算P值。*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001,****表示P<0.000 1。图中显示的差异统计分析均为与含有6个NGS组的比较结果。

2 结果

2.1 G57基因型H9N2病毒HA糖基化模式分析利用最大似然法对NCBI和GISAID数据库中我国G57基因型H9N2毒株(n=5 271)的糖基化基序(NGS)进行统计分析,发现G57基因型病毒HA基因共有5种不同的糖基化模式:在2007年首次分离的G57基因型H9N2毒株的HA有7个NGS;从2010年开始,又陆续出现了6～3个NGS不等的糖基化模式。如图1A所示,所有这些模式均包含N133,297和484位3个NGS。从毒株的流行优势来看,不同HA糖基化模式病毒的流行能力存在明显差异。例如,从2007年出现至今,共分离到1 314株含有7个NGS的病毒;而6个NGS首次出现于2010年,此后其毒株数量迅速递增,并于2013年在数量(n=325)上首次超过了含有7个NGS的毒株(n=220),这种流行优势一直保持至今。然而,对于5～3个NGS,每年仅能分离到少量毒株。利用PyMOL软件基于1JSD A蛋白对HA蛋白进行三维结构预测(图1B)发现,G57基因型病毒HA头部最多含有2个NGS,茎区含有2～5个NGS。

A.HA糖基化模式毒株数量统计;B.HA蛋白糖基化模式三维结构图

2.2 G57基因型H9N2病毒HA糖基化基序出现频率与修饰潜能由G57基因型H9N2病毒HA糖基化基序出现概率的分析结果(图2)可知,133,297和484是严格保守的NGS,21,290和305是高度保守的NGS,而210位NGS不是G57基因型病毒HA糖基化的首选位点。利用NetNGlyc1.0软件对G57基因型病毒5种HA基因糖基化模式中各个NGS被糖基化修饰潜能(表1)的分析结果显示,在5种模式中,所有NGS均有被糖基化的可能。

表1 G57基因型H9N2病毒HA各NGS被糖基化修饰潜能

图2 G57基因型H9N2病毒HA糖基化基序出现频率的统计结果

2.3 病毒生长动力学曲线为了研究HA不同糖基化模式对病毒体外增殖能力的影响,将5株病毒分别以MOI=0.1和MOI=0.01感染CEF细胞,绘制病毒的一步和多步生长动力学曲线。病毒一步生长动力学曲线(图3A)显示,在感染后0～10 h,reHA6滴度极显著高于其余4株病毒(P<0.01～0.000 1),在感染后12 h,reHA6滴度显著高于reHA4和reHA3(P<0.05)。由多步生长动力学曲线(图3B)结果可知,5株病毒均能在感染后36～48 h达到最高病毒滴度,在感染后36 h,reHA6滴度极显著高于reHA4和reHA3(P<0.001);在感染后48 h,reHA7滴度显著高于reHA6(P<0.05),reHA6显著高于reHA5(P<0.01);在感染后60 h时,reHA6滴度显著高于reHA5(P<0.001)。

A.一步生长;B.多步生长

2.4 pH值稳定性测定结果酸稳定性是禽流感病毒适应哺乳动物的基础。为了探究5种HA糖基化模式病毒在不同pH值条件下的稳定性,将各病毒与不同pH值的缓冲液等体积混合,37℃孵育后,通过血凝试验比较它们的血凝活性变化以评价病毒的酸稳定性。结果如图4A所示,与在中性缓冲液中相比,所有毒株处于酸性缓冲液时的HA滴度均有所下降。其中,当pH=6或5时,各株病毒仍有较高的血凝活性;当pH=4时,尽管reHA5、reHA6、reHA7仍具有血凝活性(HA≥2log2),然而reHA4和reHA3完全失去了血凝活性。由此表明,reHA5、reHA6、reHA7具有更好的酸稳定性,而reHA4、reHA3在低pH值环境下的稳定性较差。

2.5 热稳定性测定结果温度是环境和动物机体的固有参数,对病毒粒子的侵染活性有重要的影响。保持热稳定性,不仅有利于HA蛋白在较高温度下的正确折叠,而且是病毒感染温度相对较高的内脏器官的基础[8]。为了探究不同HA糖基化模式对病毒热稳定的影响,将各糖基化模式病毒在50℃或56℃下处理不同时间,并在特定时间点取样进行血凝测定,以病毒血凝滴度的变化评价病毒的热稳定性。在相同温度下,随着处理时间的延长,各糖基化模式病毒的血凝活性逐渐减弱。在不同温度、相同处理时间下,随着温度的升高,各糖基化模式病毒的血凝活性逐渐减弱。在50℃时,reHA3在3 h时、reHA4在4 h时完全失去了血凝活性,而reHA6、reHA7仍然保持血凝活性(图4B)。在56℃处理20 min时,reHA3、reHA4完全失去了血凝活性,reHA5、reHA7、reHA6依次在25,30和35 min时失去血凝活性(图4C)。由此可见,reHA6的热稳定性最好,reHA7次之。

2.6 红细胞洗脱试验测定病毒的受体亲和性通过测定各病毒从RBC上的洗脱时间,以此比较各糖基化模式病毒HA结合鸡RBC的能力差异。结果如图5A所示,reHA7、reHA6、reHA5、reHA4、reHA3从鸡RBC表面解离的时间分别为6,5.5,4.5,4和4 h。从30 min开始,各病毒HA滴度均开始下降;在2 h以后,reHA5、reHA4、reHA3的HA滴度下降速度加快;在4 h以后,reHA6的HA滴度下降速度增快,而reHA7能够维持较高的HA滴度以更长时间。由此表明,reHA7具有更强的RBC结合能力,reHA6次之,reHA5、reHA4、reHA3较弱。

2.7 红细胞凝集试验测定病毒的受体亲和性受体破坏酶RDE可以去除鸡RBC表面的SA。将用RDE处理过的RBC与等量的各糖基化模式病毒混合后进行血凝试验,通过比较可以完全血凝的RDE的最高浓度来评价各糖基化模式病毒的受体亲和性。允许病毒完全血凝的RDE的浓度越高,代表其受体亲和性越好。结果如图5B所示,reHA7保持完全血凝活性的RDE的使用浓度最高,reHA3保持完全血凝的RDE的使用浓度最低。由此表明,reHA7的受体亲和性最好,reHA6、reHA5次之,reHA4、reHA3最低。

2.8 固相结合试验测定病毒的受体亲和性为了研究HA糖基化模式对病毒受体亲和性的影响,通过固相结合试验分析各HA糖基化模式病毒与禽型受体3′SLN和人型受体6′SLN的结合能力。由图5C～D可知,5株病毒均可与两种类型受体结合。与3′SLN和6′SLN的结合曲线均显示,reHA7与3′SLN和6′SLN的结合能力最强,reHA6、reHA5次之,而reHA4、reHA3最弱。因此,无论是对禽型受体的亲和性,还是对人型受体的亲和性,reHA7受体亲和性最强,reHA6、reHA5次之,而reHA4、reHA3最弱。

A.RBC洗脱曲线;B.与RBC受体的亲和性;C.与3′SLN亲和性;D.与6′SLN亲和性

3 讨论

当前,H9N2亚型禽流感病毒流行于世界范围内的多种禽鸟之间,并且反复地感染包括人类和猪在内的哺乳动物,严重威胁社会及公众健康。HA蛋白是甲型流感病毒表面的一种重要糖蛋白,其糖基化位点的数量和位置的改变会影响HA的结构,进而影响其感染力、复制力、毒力、致病力、免疫逃逸等能力[9]。研究表明,HA裂解位点附近的糖基化位点的变化会影响病毒的毒力;而位于抗原表位附近的糖基化位点的变化会影响病毒与抗体的结合,使病毒能够逃逸宿主免疫;但是也有某些位置的糖基化位点变化对HA的结构和功能没有影响[10-11]。针对人流感病毒(如H1和H3)的研究发现,糖基化可以帮助病毒逃逸宿主的先天性免疫,而H5N1病毒糖基化位点的缺失会影响病毒在细胞中的增殖[12]。但是,对于H9N2病毒的糖基化位点变化的研究大多是基于流行病学调查分析,而鲜有基于其效应的研究。本研究通过下载NCBI和GISAID数据库中我国H9N2病毒的HA基因并构建进化树分析,发现BJ94分支中的G57基因型是当前流行于我国的优势基因型(表1)。据此,对其HA基因序列进行分析,发现G57基因型存在5种不同的糖基化模式(图1A)。因此,本研究利用反向遗传技术并成功拯救了5株不同HA糖基化模式的病毒。

病毒的稳定性试验结果表明,不同HA糖基化模式的病毒对低pH和高温环境表现出的敏感性不同(图4)。HA的热稳定性和酸稳定性对病毒生物学活性(如复制能力)具有重要影响,是病毒适应外界环境的重要指标。如GU等[13]研究证明,HA蛋白热稳定性强的毒株在自然环境中保持侵染活性的能力相对较强。GUO等[14]研究表明,酸稳定性强的流感减毒活疫苗LAIV株复制能力和免疫原性都较强。而本研究中各HA模式病毒在CEF细胞上的增殖曲线结果(图3)与其稳定性试验结果有着相似的趋势也印证了这一点。由此推测,糖基化位点的差异造成了不同HA糖基化模式病毒的稳定性差异,从而导致其在细胞上的增殖能力差异。

AIVs在感染细胞过程中,HA与细胞表面的唾液酸(sialic acid,SA)受体特异性结合,使病毒吸附于细胞表面进而通过内吞作用进入细胞。在本研究中(图5A)reHA7具有更强的RBC结合能力,reHA6则具有更佳的热稳定性,而它们的差异仅仅在有无第210位糖基化位点,说明HA第210位糖基化的缺失可以显著降低H9N2病毒结合鸡RBC的能力,廖昌涛等[12]也出现相似结果。另外,虽然AIVs受体结合特性的变化通常是由HA蛋白受体结合区(receptor binding domain,RBD)的关键氨基酸突变引起,但已有研究证明,第158位糖基化位点的缺失对于H5病毒获得6′SLN亲和能力同样非常重要[15]。鸡RBC凝集试验结果显示(图5B),允许reHA7完全血凝的RDE的浓度最高,表明相对于其他糖基化模式病毒而言,其受体亲和性最强。而在固相结合试验中,这5种HA糖基化模式病毒均能与6′SLN和3′SLN受体结合(图5C-D),暗示它们可能具有跨种传播的潜能。从受体亲和性变化的趋势来看,不同HA糖基化模式病毒在相同浓度的同一受体下的受体亲和性不同,而这5种糖基化模式病毒的HA除糖基化位点存在差异以外,其余位点均相同,因此可以推测这5种糖基化模式病毒的受体结合能力差异有可能是由于彼此之间的糖基化位点差异引起的。与此同时,5种糖基化模式病毒表现出对人源α-2,6SA的偏嗜性,这或许与HA的RBD的226,227位点氨基酸为L、M有关[16]。另外,有研究表明,中国早期的H9N2病毒优先结合α-2,3SA,但随着病毒的持续流行,病毒的受体亲和性发生变化,近些年流行的H9N2病毒表现出双嗜性,并且结合6′SLN的能力高于3′SLN,或者优先结合6′SLN[17-20]。综合试验结果考虑,糖基化或许也在其中发挥着一定的作用。谭刘刚[15]利用固相结合试验分析了2株突变病毒(HA-N305Q、HA-N210Q)对6′SLN的亲和性,结果显示,210或305位糖基化位点缺失后的突变病毒对6′SLN的亲和性减弱。在本研究中,reHA7与reHA6、reHA6和reHA5在同6′SLN的亲和性变化趋势中(图5D)也得到了相似的结果,而reHA7与它们的糖基化差异位点也恰好为210或305位。由此证明,HA第210与305位糖基化位点的变化对H9N2病毒的受体亲和性具有显著影响。

在甲型流感病毒的进化过程中,HA糖基化位点的数量有逐渐增加的趋势,这被认为是病毒进化的一种选择优势。然而,HA不会不加节制地进行糖基化修饰,它必须考虑由此带来的适应性成本。HA糖基化修饰的前提是,需要在免疫逃逸和受体亲和性之间寻求一种最佳的平衡状态。当HA糖基化达到临界水平时,为了保持病毒的适应性,甲型流感病毒可以通过转换NGS的位置,即某一位置NGS的消失伴随着另一位置NGS的出现,以此对自身糖基化程度设置一个适宜的阻力。尽管本研究对HA糖基化模式对病毒的稳定性、增殖能力和受体亲和性的影响进行了比较,但不同HA糖基化模式病毒的出现,是否伴随着“代偿效应”,这值得进一步探究。