固脾消积饮对肝星状细胞共培养条件下HepG2细胞氨基酸代谢和能量代谢的影响

柳卓 ，田雪飞 谭小宁 ，郜文辉 翦慧颖 李可心 周琳 张振 曾普华

1.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 412000； 2.湖南中医药大学，湖南 长沙 412006；3.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 412000

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，居恶性肿瘤发病率第6位、病死率第4位[1]，其高发病率和高致死率对我国居民健康造成了极大威胁。肝癌起病隐匿，绝大部分患者确诊时已处于中晚期，治疗复杂且手段局限，同时面临费用高、起效慢、不良反应大等问题。因此亟需安全、经济、有效的药物和治疗手段。

目前，肝癌发病机制尚未完全阐明，随着能量代谢和氨基酸代谢及参与代谢反应的酶逐渐被发现，其中的关键物质可能成为肿瘤治疗的新靶点[2]。近年来，肝星状细胞和肝癌细胞的关系引起研究者关注，特别是肿瘤细胞和成纤维细胞之间的交流已扩大至肿瘤代谢层面[3]。

固脾消积饮（原益气化瘀解毒方）是国医大师潘敏求团队研发的治疗原发性肝癌经验方，已在临床应用30余年，该方以四君子汤为基础加减，具有益气健脾、化瘀散结、清热解毒等作用[4]。前期药理研究表明，该方具有调节免疫、稳定瘤体、抗复发和转移等作用[5-6]。本研究结合人肝癌细胞HepG2和肝星状细胞LX-2共培养模型，基于氨基酸代谢和能量代谢观察固脾消积饮对肝癌细胞代谢的影响，为中医药防治肝癌提供实验依据。

1 实验材料

1.1 细胞和动物

HepG2细胞，湖南省中医药研究院附属医院中心实验所惠赠；LX-2细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司。SPF级雄性SD大鼠20只，体质量220～240 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（湘）2019-0004。本实验经湖南省中医药研究院动物伦理委员会批准（2019-0071），对实验动物的处理均遵循《实验动物质量管理办法》实施。

1.2 药物

固脾消积饮（白参10 g，黄芪30 g，半枝莲30 g，重楼15 g，醋莪术15 g，甘草5 g），饮片购于湖南省中医药研究院附属医院中药房，用适量冷水浸泡30 min，大火煮沸后转小火煮30 min，煎煮2次，合并煎煮液，过滤后浓缩至含原药材1.8 g/mL，4 ℃冰箱保存。

1.3 主要试剂与仪器

DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶，美国Gibco，批号分别为A4192101、10100147、25200072；Seahorse XF RPMI培养基，美国Agilent公司，批号00620006；CCK8试剂盒，上海碧云天，批号C0073；丙酮酸、葡萄糖ELISA试剂盒，南京建成，批号A081、F006；丙二醛（MDA）检测试剂盒，英国Abcam公司，批号GR33333591；糖酵解速率测定试剂盒，美国Agilent公司，批号26817104；三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）ELISA检测试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司，批号201651、206021；腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）α一抗、p-AMPKα（Thr172）一抗，美国CST公司，批号#5831、#50081。SW-CJ-2F型超净工作台，苏州安泰公司；EIX808U型酶标仪，美国BioTek公司；1100型高效液相色谱仪，德国安捷伦；Seahorse XFe96型能量代谢分析仪，美国Agilent公司；XDS-600C型倒置荧光显微镜，日本奥林巴斯公司；Mini Protean 3 Cell型电泳仪，美国Bio-Rad公司；GBox XRQ型凝胶成像仪，中国GeneCompany公司。

2 实验方法

2.1 细胞培养

LX-2细胞和HepG2细胞用含10%胎牛血清的完全培养基，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。细胞生长至80%后进行传代，取对数生长期细胞进行实验。

2.2 共培养体系建立

Transwell共培养体系由上室和下室组成，上室为聚碳酸酯膜（孔径0.45 μm）做成的小室，下室为培养板。将HepG2细胞以2.5×105个/mL接种于下室，每孔2 mL；LX-2细胞接种于上室，密度5×104个/mL，每孔1 mL。置于培养箱培养24 h。

2.3 含药血清制备

20只大鼠随机分为空白组10只、中药组10只，分别予蒸馏水、21.6 g/kg固脾消积饮浓缩液灌胃，体积2 mL/100 g，连续灌胃5 d。第6日腹主动脉取血，3 000 r/min离心10 min，收集血清，56 ℃水浴锅灭活30 min，0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，-80 ℃保存。

2.4 分组和给药

将单独培养的HepG2细胞和共培养体系各分为对照组（胎牛血清）、阳性药组（胎牛血清）、空白血清组（5%、10%、20%）和中药血清组（5%、10%、20%），分别加入相应血清培养，阳性药组加入20 μg/mL顺铂，置于培养箱培养24 h。

2.5 CCK8法检测细胞活力

干预24 h后，向HepG2细胞中加入CCK8溶液100 μL，培养箱静置2 h，酶标仪波长450 nm测定各孔光密度（OD值）。

2.6 细胞状态观察

培养24 h后，弃去上清液，向HepG2细胞中加入DAPI，避光充分染色10 min，PBS洗涤，荧光显微镜下观察并拍照。

2.7 ELISA检测

收集HepG2细胞上清液，按照试剂盒说明书检测TG、TC、丙酮酸和葡萄糖含量。

2.8 丙二醛含量检测

使用胰蛋白酶消化HepG2细胞，收集细胞，按照试剂盒说明书检测细胞内MDA含量。

2.9 糖酵解速率测定

干预24 h后，向HepG2细胞中加入Seahorse XF RPMI培养基2 mL，将细胞放入无CO2培养箱中静置1 h，按照糖酵解速率测定试剂盒上机检测。

2.10 Western blot检测

取10%固脾消积饮含药血清分别干预HepG2细胞和共培养体系，处理24 h后，提取蛋白，检测蛋白浓度。取100 μg蛋白上样，电泳，5%脱脂奶粉封闭1 h，加入AMPK、p-AMPKα一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，加二抗，摇床孵育2 h，洗膜后用凝胶成像仪成像，计算蛋白相对表达量。

2.11 氨基酸含量检测

取10%空白血清和10%固脾消积饮含药血清分别干预HepG2细胞和共培养体系，培养24 h后，精确称取细胞上清液0.2 g，加入6 mol/L盐酸5 mL，涡旋振荡1 min混匀，110 ℃反应24 h，冷却至室温，加入NaOH配制成中性溶液，5 000 r/min离心10 min，吸取上清液1 mL，加入0.5 mol/L碳酸氢钠溶液（pH=9.0）1 mL、DNFB溶液1 mL混匀，避光反应60 min。冷却，加磷酸盐缓冲液定容至5 mL，涡旋混匀，静置15 min，取1 mL，经0.22 μm滤膜过滤，待测。

色谱条件：安捷伦C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，0.5 μm），流动相为1 mol/L乙酸钠溶液（pH=5.3）-甲醇水（1∶1），柱温40 ℃，流速1 mL/min，进样量20 μL，检测波长360 nm。

3 统计学方法

采用SPSS26.0统计软件进行分析。计量资料以±s表示，组间比较采用方差分析，方差齐用LSD法，方差不齐用Dunnett-t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 固脾消积饮对HepG2细胞增殖的影响

CCK8法检测结果显示，与同一培养体系对照组比较，10%、20%中药血清组和阳性药组HepG2细胞活力降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。DAPI染色观察发现，对照组和空白血清组细胞数目无明显变化，中药血清各组细胞数目减少，并呈剂量依赖性，表明细胞增殖受到抑制。单独培养HepG2细胞较共培养HepG2细胞凋亡更明显，但差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1、图1。

图1 各组HepG2细胞形态（DAPI染色，×200）

表1 各组HepG2细胞活力比较（±s，OD值）

表1 各组HepG2细胞活力比较（±s，OD值）

注：与同一培养体系对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

共培养组别n 单独培养1.15±0.10 1.06±0.07 1.16±0.06 1.08±0.05 1.06±0.09 0.43±0.05**0.38±0.03*0.40±0.06**对照组5%空白血清组10%空白血清组20%空白血清组5%中药血清组10%中药血清组20%中药血清组阳性药组6 6 6 6 6 6 6 6 1.25±0.08 1.22±0.01 1.24±0.02 1.21±0.01 1.05±0.09 0.42±0.02**0.35±0.02*0.39±0.02**

4.2 固脾消积饮对HepG2细胞三酰甘油、总胆固醇、丙酮酸和葡萄糖含量的影响

与同一培养体系对照组比较，10%、20%中药血清组和阳性药组细胞上清液TG、TC、葡萄糖含量显著减少（P<0.05，P<0.01），丙酮酸含量显著增加（P<0.05，P<0.01）。单独培养HepG2细胞各成分含量略低于共培养体系，但差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表2、表3。

表2 各组HepG2细胞上清液TG、TC、丙酮酸含量比较（±s，mmol/L）

表2 各组HepG2细胞上清液TG、TC、丙酮酸含量比较（±s，mmol/L）

注：与同一培养体系对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别对照组5%空白血清组10%空白血清组20%空白血清组5%中药血清组10%中药血清组20%中药血清组阳性药组n 6 6 6 6 6 6 6 6 TG单独培养1.42±0.05 1.40±0.08 1.38±0.04 1.39±0.02 1.34±0.02 1.06±0.07*1.02±0.09*1.04±0.04**共培养1.56±0.13 1.54±0.09 1.52±0.01 1.49±0.09 1.36±0.06 1.12±0.09**1.08±0.08**1.09±0.02**TC单独培养1.75±0.19 1.69±0.15 1.70±0.14 1.76±0.13 1.54±0.12 1.35±0.08**1.21±0.07**1.32±0.13**共培养1.87±0.09 1.85±0.08 1.79±0.11 1.82±0.05 1.64±0.04 1.47±0.07*1.37±0.06**1.45±0.09*丙酮酸单独培养18.05±0.08 18.01±0.05 17.89±0.03 17.76±0.09 19.28±0.16 29.15±0.25**31.21±0.35*27.27±0.43**共培养17.54±0.12 17.65±0.11 17.63±0.09 17.36±0.07 18.25±0.17 25.59±0.12*26.26±0.24*24.25±0.16*

表3 各组HepG2细胞上清液葡萄糖含量比较（±s，102 μmol/mg）

表3 各组HepG2细胞上清液葡萄糖含量比较（±s，102 μmol/mg）

注：与同一培养体系对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别对照组5%空白血清组10%空白血清组20%空白血清组5%中药血清组10%中药血清组20%中药血清组阳性药组n6 6 6 6 6 6 6 6单独培养2.08±0.08 2.05±0.04 2.02±0.01 1.98±0.06 1.97±0.04 1.25±0.07**1.12±0.05**1.19±0.06**共培养2.23±0.05 2.13±0.06 2.21±0.04 2.16±0.02 2.04±0.02 1.28±0.09**1.16±0.03**1.22±0.02**

4.3 固脾消积饮对HepG2细胞丙二醛含量的影响

与同一培养体系对照组比较，10%、20%中药血清组和阳性药组HepG2细胞MDA含量显著增加（P<0.05，P<0.01）。见表4。

表4 各组HepG2细胞MDA含量比较（±s，mmol/L）

表4 各组HepG2细胞MDA含量比较（±s，mmol/L）

注：与同一培养体系对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别对照组5%空白血清组10%空白血清组20%空白血清组5%中药血清组10%中药血清组20%中药血清组阳性药组n6 6 6 6 6 6 6 6单独培养0.76±0.06 0.75±0.03 0.77±0.04 0.72±0.01 0.87±0.07 1.12±0.09*1.03±0.02*1.11±0.06*共培养0.79±0.02 0.76±0.04 0.79±0.05 0.74±0.01 0.97±0.09 1.04±0.11**1.21±0.12*1.02±0.08*

4.4 固脾消积饮对HepG2细胞糖酵解速率的影响

与同一培养体系对照组比较，10%、20%中药血清组和阳性药组HepG2细胞糖酵解速率显著降低（P<0.05，P<0.01）。见表5。

表5 各组HepG2细胞糖酵解速率比较（±s，mpH/min）

表5 各组HepG2细胞糖酵解速率比较（±s，mpH/min）

注：与同一培养体系对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

组别对照组5%空白血清组10%空白血清组20%空白血清组5%中药血清组10%中药血清组20%中药血清组阳性药组n 6 6 6 6 6 6 6 6单独培养795.72±17.61 786.25±16.82 766.72±15.95 778.68±19.37 645.63±23.61 476.40±25.69**453.18±15.62**469.27±21.49**共培养805.50±18.92 795.38±17.76 801.31±17.42 802.10±14.87 745.31±14.27 487.76±36.51*464.92±24.91*475.34±26.72*

4.5 固脾消积饮对HepG2细胞腺苷酸活化蛋白激酶α蛋白表达的影响

与同一培养体系对照组比较，10%中药血清组细胞p-AMPKα/AMPKα比值显著升高（P<0.05）。结果见图2、表6。

图2 各组HepG2细胞p-AMPKα、AMPKα蛋白免疫印迹

表6 各组HepG2细胞p-AMPKα/AMPKα比较（±s）

表6 各组HepG2细胞p-AMPKα/AMPKα比较（±s）

注：与同一培养体系对照组比较，*P<0.05

组别单独培养对照组共培养对照组单独培养10%中药血清组共培养10%中药血清组n 6 6 6 6 p-AMPKα/AMPKα 1.12±0.05 1.09±0.04 1.75±0.03*1.74±0.01*

4.6 固脾消积饮对HepG2细胞氨基酸水平的影响

与同一培养体系对照组比较，10%中药血清组HepG2细胞上清液17种氨基酸含量均显著减少（P<0.05，P<0.01）。见表7。

表7 HepG2细胞上清液17种氨基酸含量各组比较（±s，n=3，mg/g）

表7 HepG2细胞上清液17种氨基酸含量各组比较（±s，n=3，mg/g）

注：与同一培养体系对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

序号1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 13 14 15 16 17氨基酸天冬氨酸谷氨酸丝氨酸精氨酸甘氨酸脯氨酸丙氨酸苏氨酸缬氨酸蛋氨酸胱氨酸异亮氨酸亮氨酸苯丙氨酸组氨酸赖氨酸酪氨酸单独培养对照组0.75±0.01 1.82±0.07 0.53±0.02 0.42±0.03 0.28±0.00 0.48±0.02 0.95±0.03 0.43±0.02 0.07±0.00 1.16±0.09 0.01±0.00 3.16±0.01 0.80±0.01 0.55±0.01 0.17±0.02 0.55±0.01 0.41±0.01 10%空白血清组0.74±0.02 1.80±0.02 0.54±0.05 0.41±0.02 0.24±0.00 0.42±0.02 0.94±0.02 0.43±0.04 0.07±0.00 1.15±0.05 0.00±0.00 3.02±0.08 0.75±0.01 0.54±0.00 0.16±0.02 0.54±0.01 0.40±0.01 10%中药血清组0.33±0.03*1.12±0.06*0.36±0.02**0.32±0.03*0.16±0.01**0.32±0.02**0.63±0.01**0.23±0.02*0.03±0.01*0.65±0.00**0.00±0.00 2.10±0.10*0.47±0.00**0.33±0.01*0.07±0.01*0.24±0.00*0.33±0.00*共培养对照组1.05±0.02 2.25±0.09 0.62±0.02 0.84±0.04 0.35±0.01 0.59±0.03 1.16±0.04 0.52±0.03 0.12±0.01 1.88±0.06 0.00±0.00 2.73±0.08 1.02±0.01 0.70±0.00 0.17±0.02 0.73±0.01 0.52±0.01 10%空白血清组1.04±0.01 2.24±0.03 0.69±0.05 0.83±0.05 0.34±0.02 0.56±0.02 1.23±0.04 0.53±0.02 0.11±0.01 1.88±0.04 0.00±0.00 2.87±0.03 1.01±0.02 0.65±0.00 0.15±0.01 0.71±0.00 0.50±0.00 10%中药血清组0.36±0.02*1.21±0.06*0.36±0.02*0.32±0.04*0.16±0.01**0.32±0.02**0.63±0.01*0.23±0.01*0.03±0.00**0.66±0.01*0.00±0.00 2.11±0.10*0.47±0.00**0.33±0.01*0.07±0.00*0.25±0.00*0.34±0.01*

5 讨论

肝癌能通过改变肿瘤细胞营养物质摄取和代谢途径改变新陈代谢，从而满足肿瘤细胞增殖所需条件[7-8]。AMPK是调节糖酵解等能量代谢途径的关键蛋白激酶[9]，干预肝癌细胞能量代谢和氨基酸代谢途径成为目前抑制肝癌细胞增殖的新思路。能量代谢是肿瘤细胞的特征，包括糖酵解、脂质代谢和蛋白重编程等[10]。肿瘤微环境及肿瘤细胞与微环境之间的交流在肿瘤发病机制中有基础作用[11]。肝脏是物质代谢的主要器官，对氨基酸合成与分解有执行作用，蛋白质作为细胞的基本组成部分，由氨基酸合成并能分解氨基酸[12]。氨基酸参与免疫因子的合成，能改善肿瘤免疫微环境，其活性与肝脏受损程度有关[13]。肝星状细胞是肝癌进展最主要的间质细胞，对氨基酸代谢起调节作用[3]。有研究表明，肝癌患者血清氨基酸谱发生改变[14]。

固脾消积饮具有益气化瘀、散结解毒功效。前期网络药理学研究表明，该方能诱导肝癌细胞焦亡[15]。本实验通过调整LX-2细胞和HepG2细胞密度构建共培养体系（HepG2∶LX-2=5∶1），该比例接近肝脏微环境中实质细胞与非实质细胞的比例，可更准确地模拟肝癌病理生理环境，同时以单独培养HepG2细胞作为对照，2个体系培养经不同浓度中药血清处理24 h，结果发现固脾消积饮对单独培养HepG2细胞和共培养体系HepG2细胞增殖均有抑制作用，能减少TG、TC、葡萄糖含量，增加MDA和丙酮酸含量，降低细胞糖酵解速率。氨基酸检测结果表明，10%中药血清组氨基酸含量明显低于对照组。由此可见，固脾消积饮对HepG2细胞的抑制作用与调节能量代谢和氨基酸代谢有关，结合p-AMPKα/AMPKα比值升高，推测固脾消积饮可能通过磷酸化AMPKα通路调节HepG2细胞能量代谢，促进细胞凋亡。从本实验结果来看，单独培养的HepG2细胞与LX-2/HepG2共培养体系相比有细微差别，但差异无统计学意义，初步推测LX-2细胞增强了HepG2细胞抗凋亡能力，肝星状细胞作为肝纤维化的关键细胞，与HepG2细胞相互影响、相互调控，今后将继续开展深入研究进一步验证。

综上所述，固脾消积饮可能通过磷酸化AMPKα通路调节肝癌HepG2细胞能量代谢和氨基酸，进而促进细胞凋亡。