丹参通络解毒汤对缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞自噬的影响

王婷婷，李鑫辉，戴超男，李彩云

湖南中医药大学中医学院，湖南 长沙 410208

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是人类死亡的主要病因之一，临床治疗应尽早恢复缺血心肌血流灌注[1]，但短时间内迅速恢复血流会出现更严重的损伤，即心肌缺血再灌注损伤（MIRI）。研究表明，在AMI的最终梗死面积中，约50%由缺血再灌注损伤造成[2]。再灌注期间，过度自噬导致自噬体大量积累及关键蛋白和细胞器异常降解，进而损伤细胞或诱导细胞自噬性凋亡[3-5]。因此，调节自噬对减轻MIRI有重要作用[6]。课题组前期研究发现，丹参通络解毒汤能通过下调MALAT1基因表达，抑制缺氧/复氧大鼠心肌微血管内皮细胞（CMECs）自噬[7-8]。研究表明，SRPK1对MIRI有保护作用[9]。本研究以MALAT1调节CMECs自噬为切入点，进一步明确丹参通络解毒汤调节缺氧/复氧损伤CMECs自噬的作用机制，为该方的临床应用提供实验依据。

1 实验材料

1.1 细胞及动物

CMECs，武汉普诺赛生命科技有限公司。SPF级雄性SD大鼠20只，体质量220～250 g，湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号SYXK（湘）2019-0004，常规饲养于湖南中医药大学动物实验中心SPF级动物房。本研究经湖南中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（LL2019101604）。

1.2 药物及制备

丹参通络解毒汤（丹参15 g，玄参15 g，当归10 g，黄连6 g，栀子15 g，生地黄15 g，麦冬12 g，金银花10 g，连翘10 g，黄芪30 g），饮片由湖南中医药大学第一附属医院提供。按前期方法[7]制备成含原药材4 g/mL溶液。

1.3 主要试剂与仪器

CMECs完全培养基（武汉普诺赛，货号CMR135），RNA免疫沉淀试剂盒（美国Sigma，货号RIP），TRIzol（美国Thermo，货号15596026），RIPA裂解液（上海碧云天，货号P0013B），BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京康为世纪，货号CW0014S），显影液（上海佳信，货号BW-61），SRPK1抗体（英国Abcam，货号ab90527），Beclin1抗体（英国Abcam，货号ab92389），Bcl-2抗体（英国Abcam，货号ab59348），Bax抗体（英国Abcam，货号ab182733），LC3B抗体（美国Proteintech，货号18725-1-AP），GAPDH抗体（美国Proteintech，货号10494-1-AP），反转录试剂盒（北京康为世纪，货号CW2569）。细胞培养箱（美国Thermo，型号STERI-CYCLE i250），生物安全柜（美国Thermo，型号1300 SERIES A2），荧光定量PCR仪（美国Thermo，型号PIKOREAL96），摇床（江苏其林贝尔，型号TS-1），电泳仪（北京六一，型号DYY-2C），化学发光成像系统（中国勤翔，型号ChemiScope6100），倒置荧光显微镜（厦门Motic，型号BA210T）。

2 实验方法

2.1 含药血清制备

20只大鼠随机分为对照组和丹参通络解毒汤组，每组10只。丹参通络解毒汤组按临床等效剂量15.66 g/（kg·d）灌胃，对照组灌胃等体积蒸馏水，每日2次，连续7 d。末次灌胃1 h后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，4 ℃静置4 h，3 000 r/min离心15 min，取血清，56 ℃灭活30 min，0.22 μm滤膜过滤除菌，分装，-80 ℃冰箱保存备用。

2.2 缺氧/复氧模型制备

细胞用完全培养基置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱培养，生长至80%～90%时用于实验。按课题组前期方法[10]造模：弃去原培养液，PBS冲洗3次，替换成无血清、不含糖DMEM培养基，置于37 ℃，气体体积分数为94%N2、1%O2、5%CO2培养箱中缺氧2 h，更换为完全培养基，置于常规培养箱中复氧2 h。

2.3 RNA免疫共沉淀检测

取对数生长期CMECs，胰酶消化，接种于T25细胞培养瓶中，分为空白组和模型组，空白组常规培养，模型组按“2.2”项下方法造模。收集空白组和模型组细胞，加入RIPA裂解液裂解，一部分裂解产物作为对照（Input），一部分用于与非特异性IgG结合，一部分用于与SRPK1抗体结合。免疫磁珠对裂解产物进行预清除，将5 μg IgG和SRPK1抗体（1∶2 000）分别加入裂解产物中，4 ℃孵育过夜，加50 μL免疫磁珠混匀，4 ℃孵育2 h，收集免疫磁珠，TRIzol法抽提总RNA，并进行RT-PCR，以IgG/Input及SRPK1/Input的MALAT1表达量评价IgG和SRPK1与MALAT1结合能力。上游引物：5'-GGGGGAATGGGGGCAAAATA-3'，下游引物：5'-AACTACCAGCAATTCCGCCA-3'，产物长度213 bp。

2.4 慢病毒转染

取生长状态良好的CMECs，胰酶消化，调整细胞密度为2.5×104个/mL，接种于6孔板，每孔2 mL，当细胞贴壁融合至20%～30%，根据吉凯基因重组慢病毒载体使用手册进行慢病毒转染，加入计算好的病毒液（感染指数50），置于37 ℃、5%CO2培养箱培养11 h，弃去培养液，更换为完全培养基继续培养37 h，荧光显微镜下观察转染效率，转染效率80%时效果最佳。

2.5 细胞分组及处理

取对数生长期CMECs，胰酶消化，调整细胞密度为2.5×104个/mL，接种于6孔板，先按“2.2”项下方法造模，再按“2.4”项下方法转染MALAT1沉默慢病毒，确认转染成功后，将细胞分为过表达SRPK1组（以SRPK1过表达慢病毒转染CMECs后，加入对照血清培养基干预24 h）、过表达SRPK1联合含药血清组（以SRPK1过表达慢病毒转染CMECs后，加入丹参通络解毒汤含药血清培养基干预24 h）、空载组（以空载慢病毒转染CMECs后，加入对照血清培养基干预24 h）、空载联合含药血清组（以空载慢病毒转染CMECs后，加入丹参通络解毒汤含药血清培养基干预24 h），根据课题组前期实验结果[10]，使用15%含药血清。

2.6 Western blot检测

干预结束后加入RIPA裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，上样、电泳、转膜后，以5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加Bcl-2一抗（1∶500）、Bax一抗（1∶2 000）、LC3B一抗（1∶300）、Beclin1一抗（1∶2 000）、GAPDH一抗（1∶3 000），4 ℃孵育过夜，加二抗室温孵育90 min，ECL显色曝光，凝胶成像系统成像，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

2.7 RT-PCR检测

干预结束后收集细胞，TRIzol法提取总RNA，采用反转录试剂盒对总RNA进行反转录，产物用于荧光定量PCR，反应条件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30s，共40个循环。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法分析各基因相对表达量。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因PCR引物序列

2.8 免疫荧光染色

干预结束后收集细胞，将TC处理的细胞爬片放入浸润好的6孔板中，调整细胞密度为2.5×104个/mL，接种于爬片，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养24 h。4%多聚甲醛固定爬片，加入0.3%Triton X-100，37 ℃通透30 min，PBS洗3次，每次3 min，滴加5%BSA封闭1 h，滴加LC3B一抗（1∶200），4 ℃孵育过夜，次日加入荧光二抗，37 ℃孵育90 min，PBS洗涤3次，每次5 min。DAPI染细胞核，37 ℃孵育10 min，缓冲甘油封片，于荧光显微镜下观察并采集图像，应用Image J软件对图片进行半定量分析，测量平均荧光强度。

3 统计学方法

采用SPSS26.0统计软件进行分析。符合正态分布数据以±s表示，方差齐多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 MALAT1与SRPK1结合情况验证

利用IgG及SRPK1抗体结合免疫磁珠富集总RNA后进行RT-PCR检测，结果显示，与同组IgG/Input比较，空白组和模型组与SRPK1抗体结合的MALAT1显著升高（P<0.01），见表2。表明MALAT1与SRPK1蛋白存在特异性结合。

表2 IgG、SRPK1与MALAT1结合能力比较（±s）

表2 IgG、SRPK1与MALAT1结合能力比较（±s）

注：与同组IgG/Input比较，**P<0.01

SRPK1/Input组别n IgG/Input 2.63±0.03**2.60±0.22**空白组模型组3 3 1.00±0.08 0.81±0.21

4.2 丹参通络解毒汤含药血清对细胞自噬和凋亡相关蛋白表达的影响

与过表达SRPK1组比较，过表达SRPK1联合含药血清组和空载组细胞Bcl-2蛋白表达显著升高（P<0.01，P<0.05），Bax、Beclin1蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值显著降低（P<0.01）；与过表达SRPK1联合含药血清组比较，空载联合含药血清组细胞Bcl-2蛋白表达显著升高（P<0.01），Bax、Beclin1蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值显著降低（P<0.01）；与空载组比较，空载联合含药血清组细胞Bcl-2蛋白表达显著升高（P<0.01），Bax、Beclin1蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值显著降低（P<0.01）。见表3、图1。

表3 各组细胞Bax、Bcl-2、Beclin1蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值比较（±s）

表3 各组细胞Bax、Bcl-2、Beclin1蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值比较（±s）

注：与过表达SRPK1组比较，*P<0.05，**P<0.01；与过表达SRPK1联合含药血清组比较，##P<0.01；与空载组比较，&&P<0.01

组别过表达SRPK1组过表达SRPK1联合含药血清组空载组空载联合含药血清组n3 3 3 3 Bcl-2 0.11±0.02 0.20±0.04*0.31±0.01**0.44±0.03##&&Bax 0.40±0.07 0.30±0.04**0.23±0.03**0.11±0.02##&&LC3BⅡ/LC3BⅠ1.00±0.30 0.36±0.01*0.23±0.02*0.07±0.01##&&Beclin1 1.00±0.03 0.70±0.03**0.52±0.02**0.20±0.04##&&

图1 各组细胞Bax、Bcl-2、Beclin1、LC3B蛋白免疫印迹

4.3 丹参通络解毒汤含药血清对细胞LC3B mRNA表达的影响

与过表达SRPK1组比较，过表达SRPK1联合含药血清组和空载组细胞LC3B mRNA表达显著降低（P<0.05）；与过表达SRPK1联合含药血清组比较，空载联合含药血清组细胞LC3B mRNA表达显著降低（P<0.01）；与空载组比较，空载联合含药血清组细胞LC3B mRNA表达显著降低（P<0.01）。见表4。

表4 各组细胞LC3B mRNA表达比较（±s）

表4 各组细胞LC3B mRNA表达比较（±s）

注：与过表达SRPK1组比较，*P<0.05；与过表达SRPK1联合含药血清组比较，##P<0.01；与空载组比较，&&P<0.01

组别过表达SRPK1组过表达SRPK1联合含药血清组空载组空载联合含药血清组n 3 3 3 3 LC3B 1.00±0.01 0.66±0.02*0.55±0.02*0.40±0.02##&&

4.4 丹参通络解毒汤含药血清对细胞LC3B蛋白表达的影响

与过表达SRPK1组比较，过表达SRPK1联合含药血清组和空载组细胞LC3B表达降低（P<0.01）；与过表达SRPK1联合含药血清组比较，空载联合含药血清组细胞LC3B表达降低（P<0.01）；与空载组比较，空载联合含药血清组细胞LC3B表达降低（P<0.01）。见图2、表5。

图2 各组细胞LC3B阳性表达（免疫荧光染色，×400）

表5 各组细胞LC3B表达比较（±s，平均荧光强度）

表5 各组细胞LC3B表达比较（±s，平均荧光强度）

注：与过表达SRPK1组比较，**P<0.01；与过表达SRPK1联合含药血清组比较，##P<0.01；与空载组比较，&&P<0.01

组别过表达SRPK1组过表达SRPK1联合含药血清组空载组空载联合含药血清组n 3 3 3 3 LC3B 77.42±1.51 56.96±3.35**42.81±2.24**31.36±1.19##&&

5 讨论

AMI属中医学“胸痹”“心痛”“真心痛”等范畴。胸痹与热、毒、瘀关系密切，火热瘀结，毒损心营，引发胸痹、心痛[11-12]。丹参通络解毒汤由李鑫辉教授根据《温病条辨》清营汤和《时方歌括》丹参饮化裁而成，具有活血通络、清营解毒、益气养阴功效。前期药理研究表明，该方可减轻MIRI大鼠心肌细胞损伤，保护受损心肌细胞，其机制与抑制自噬有关[13-14]。本实验以沉默MALAT1抑制缺氧/复氧损伤CMECs自噬为切入点，进一步明确丹参通络解毒汤调节缺氧/复氧损伤CMECs自噬的作用机制。

MALAT1是一种长链非编码RNA，在哺乳动物中含量非常丰富，且在全长范围内高度保守，在人和鼠2个物种之间，MALAT1的高度同源序列位于其3'端[15-17]。MALAT1在调节心脏功能上发挥重要作用[18]，其高表达被认为是AMI新的生物标志物[19]。SRPK1/2抑制剂能减轻心肌缺血再灌注所致大鼠心脏损伤，保护心肌结构[20]。有研究发现，在结直肠癌细胞株内，MALAT1与SRPK1蛋白存在相互作用[21]。本实验结果表明，在缺氧/复氧刺激下，大鼠CMECs中MALAT1与SRPK1蛋白同样存在特异性结合。

基础水平的自噬是对压力的保护性反应，通过清除受损的蛋白质和老化的细胞器维持细胞内稳态。再灌注阶段自噬相关因子表达升高，导致过度自噬，诱导细胞自噬性死亡，加重心肌细胞凋亡[22]。因此，适当调控自噬有助于防治MIRI。Beclin1和LC3BⅡ/LC3BⅠ比值可用于反映自噬程度，Bcl-2和Bax是调节细胞凋亡的最主要因子。有研究显示，缺氧/复氧损伤可上调小鼠心肌细胞MALAT1基因表达[23-24]。课题组前期研究也发现，丹参通络解毒汤能通过下调MALAT1基因表达抑制TLR4/NF-κB信号通路，降低自噬水平，保护心肌组织[7-8]。本实验结果表明，在沉默MALAT1基础上过表达SRPK1，缺氧/复氧损伤CMECs Beclin1和Bax蛋白表达、LC3B mRNA和蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值升高，Bcl-2蛋白表达降低，提示过表达SRPK1可逆转沉默MALAT1对缺氧/复氧损伤CMECs自噬及凋亡的抑制作用。在沉默MALAT1基础上过表达SRPK1，再予丹参通络解毒汤含药血清干预，缺氧/复氧损伤CMECs Beclin1和Bax蛋白表达、LC3B mRNA和蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值降低，Bcl-2蛋白表达升高，表明丹参通络解毒汤可抑制缺氧/复氧损伤CMECs自噬与凋亡。而仅在沉默MALAT1基础上予丹参通络解毒汤含药血清干预，缺氧/复氧损伤CMECs Beclin1和Bax蛋白表达、LC3B mRNA和蛋白表达及LC3BⅡ/LC3BⅠ比值最低，Bcl-2蛋白表达最高，说明丹参通络解毒汤能通过下调MALAT1、抑制SRPK1表达，抑制缺氧/复氧损伤CMECs自噬和凋亡。

综上所述，丹参通络解毒汤抑制缺氧/复氧损伤CMECs自噬、保护CMECs作用可能与下调MALAT1、抑制SRPK1表达有关。本研究结果可为中医药防治AMI提供实验依据。