易损斑块相关生物标志物的研究进展

葛强，徐政昊，袁蔚，申潇竹，刘希光

1.徐州医科大学附属连云港医院，江苏连云港 222002；2.连云港市第二人民医院老年医学科，江苏连云港 222000

动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是一种可累及全身各处动脉的自身免疫性疾病，主要为大中动脉，病因错综复杂。病程进展缓慢，呈进行性加重，一般从脂质沉积、局灶性纤维化、粥样斑块逐渐发展为管壁弹性下降、管腔狭窄，最终导致动脉闭塞，引起心肌梗死或缺血性卒中等急性事件。在动脉粥样硬化患者中，颈动脉斑块往往是最早识别的靶点，可通过观察颈动脉的状态来评估其他动脉血管情况。不仅如此，颈动脉斑块的形成可独立预测脑血管紧急事件的发生，约20%的缺血性卒中源于它。有研究发现，颈部非狭窄性易损斑块对卒中的发生及后续复发风险均有重要的影响[1-2]。因此尽早发现易损斑块，积极治疗，可预防急性脑血管意外。但是易损斑块的形成机制仍不是很明确，故本文对颈动脉易损斑块形成的发病机制进行了总结，以寻找可以作为治疗靶点的循环生物标志物，为指导临床治疗提供依据。

1 易损斑块

动脉粥样硬化斑块根据其稳定性可分为稳定斑块和易损斑块，易损斑块通常指那些容易形成血栓或短期内极可能快速进展的斑块。易损斑块的发生机制相当复杂，比较常见的有慢性炎症、脂质代谢紊乱、氧化应激反应、内皮损伤及血流动力学改变、巨噬细胞凋亡和表型极化等[3]。在晚期动脉粥样硬化斑块中，纤维帽破裂是加速斑块生长的主要因素并经常导致心脑血管意外的发生，Redgrave等[4]进一步将斑块细分为稳定的、主要稳定的、具有完整纤维帽的不稳定斑块和纤维帽破裂的不稳定斑块4 种类型。易损斑块通常具有薄的纤维帽、富含脂质的坏死核心，其特征有炎症过程、巨噬细胞浸润和新生血管形成等，特别是斑块内出血更容易促使易损斑块的形成[5]。

2 T 淋巴细胞和巨噬细胞在易损斑块中的重要作用

T 细胞和巨噬细胞在易损斑块中大量存在，不同功能状态的T 淋巴细胞和巨噬细胞之间必然存在复杂的细胞间相互作用，共同参与了动脉粥样硬化斑块的形成及心脑血管意外的发生。

2.1 T 细胞

斑块中的T 细胞主要为CD4+和CD8+T 细胞，其细胞亚群较血液中更为活跃，CD8+T 细胞占比更多，其可被不同程度激活而后衰竭，所以斑块内表现为活化和衰竭的T 细胞亚群并存的局面[6]。长期慢性炎症刺激可使T 淋巴细胞衰竭，此时T 淋巴细胞失去其强大的效应器功能，并表达多种抑制性抗体，如靶向程序性死亡蛋白 1（programmed death-1，PD-1）、细胞毒性T 淋巴细胞抗原 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA4）等[7]。但这一过程是可逆的，为免疫疗法提供了可能。Fernandez 等[8]分析信号通路发现γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）和PD-1 信号传导被同时激活，再次证实了斑块中同时存在激活的、促炎的和衰竭的CD8+T 细胞。此外，在无症状斑块中由肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）和IFN-γ 配体驱动的CD4+和CD8+T 细胞之间的配体-受体相互作用可能促进炎症反应。调节性T 细胞（regulatory T cells，Tregs）具有抗动脉粥样硬化作用，通过分泌白细胞介素（interleukin，IL）-10、IL-35 和转录生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）来抑制炎症细胞的募集和活化，还可以抑制T 细胞向Th1 和Th17 亚型分化，发挥诱导、维持免疫稳态及免疫耐受的作用[9]，对本质为自身免疫性疾病的动脉粥样硬化斑块的稳定颇有益处。另外还能促进胶原合成和平滑肌细胞（smooth muscle cell，SMC）增殖，进而增强斑块稳定性，且该效应是通过诱导巨噬细胞向M2 型分化实现的[10]。由此可见T 细胞在易损斑块形成过程中发挥了至关重要的作用，且与巨噬细胞密不可分。

2.2 巨噬细胞

巨噬细胞积聚在动脉粥样硬化累及的动脉壁内是一种常见的现象，巨噬细胞的表型很大程度上影响了疾病的未来走向。炎性巨噬细胞M1 分泌促炎因子促进动脉粥样硬化的发展及破坏斑块稳定性，抗炎巨噬细胞M2 则对动脉粥样硬化斑块有保护作用，两种表型的转化趋势受斑块微环境中多种因子调节，如Toll 样受体(Toll-like receptors,TLR)、细胞因子、氧化脂质等会使斑块巨噬细胞的极化偏向促炎M1 表型且远离抗炎M2 表型[11]。Huang 等[12]在小鼠体内发现，巨噬细胞中TLR2 和TLR4 信号传导在转录因子Sub1 介导下发挥促炎和促动脉粥样硬化作用。M2 型巨噬细胞能延缓斑块发展，由CD206 标记的2 个巨噬细胞亚群（CD64+HLADR+CD206hi、CD64+HLADR+CD206lo）组成，约占斑块巨噬细胞的47%[8]。细胞外基质降解往往会导致斑块不稳定，然而巨噬细胞在上调人基质金属蛋白酶组织抑制因子-1（human tissue inhibitors of metalloproteinase-1，TIMP-1），减少细胞外基质降解的同时，却降低了斑块稳定性[8]，可能是M1 和M2 型巨噬细胞共同作用的结果。研究表明，当动脉粥样硬化进展到晚期时，除出现特异性临床表现外，心肌梗死及肿瘤相关的一种血清长链非编码RNA-MIAT 的表达也会出现异常升高，而抑制MIAT 基因表达有助巨噬细胞清除凋亡细胞，减弱动脉粥样硬化的进展，减少坏死核心的大小，并增加斑块的稳定性[13]。此外，miR-149-5p过表达会通过调控靶向组蛋白去乙酰化酶4 及神经肽2 来抑制血小板衍生的生长因子BB 触发的血管平滑肌细胞的增殖、入侵和迁移[14-15]。生物信息学分析预测miR-149-5p 在circDHCR24 的3'-UTR 具有互补的结合位点，荧光素酶报告基因实验和RIP 实验进一步验证了circDHCR24 在人主动脉血管平滑肌细胞中作为miR-149-5p 的海绵[16]。Ye 等[17]研究发现，MIAT作为微小RNA（micro RNA，miRNA）海绵，通过海绵作用于miR-149-5p，正向调节抗吞噬分子CD47的表达，进一步确定了巨噬细胞MIAT/miR-149-5p/CD47 通路也是动脉粥样硬化斑块发展过程中的关键因素。研究表明，含有大量巨噬细胞的颈动脉匀浆中存在大量基质金属蛋白酶降解基质，形成扩张性动脉重塑，最终导致斑块易损的风险提高[18]。

3 循环生物标志物在易损斑块中的作用机制

3.1 肿瘤坏死因子受体家族相关蛋白和干扰素调节因子-5

一项以小鼠为实验对象的研究中，肿瘤坏死因子受体家族相关蛋白（glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor，GITR）的缺陷会导致单核细胞聚集障碍，活性氧产生受限，及巨噬细胞数量减少，还会抑制线粒体功能、免疫和炎症通路，使巨噬细胞促进炎症的能力下降，从而减少易损斑块形成，反之则促进[19]。小鼠的GITR 免疫反应模式与人类相似。此外，研究发现干扰素调节因子-5（interferon regulatory factor 5，IRF-5）与整合素CD11c 在基因表达水平、免疫阳性斑块面积高度相关，特别是它们的蛋白表达有共同的定位，主要在斑块的肩部区域[20]。IRF-5 诱导的CD11c+巨噬细胞可通过下调桥接分子Mfge8-αvβ3 整合素通路来降低胞吐能力，从而增加斑块及坏死核心的大小[21]。故GITR 和IRF-5也是引起动脉粥样硬化易损斑块的一个机制。

3.2 几丁质酶3 样蛋白1

几丁质酶3 样蛋白1(chitinase-3-like 1，CHI3L1)是一种分泌型糖蛋白，属于糖苷水解酶家族18 的一员，其表达水平以往常作为反映肝纤维化程度的关键指标。近年来研究关注的重点多为炎症、肿瘤相关巨噬细胞活化、血管生成等[21]。与此同时，CHI3L1对颈动脉斑块的影响近些年也受到了广泛关注，其作用机制比较复杂。一方面，CHI3L1 在有症状的颈动脉粥样硬化患者的血清中较健康人群含量增多，该现象可能为环境适应性反应，旨在阻止血管平滑肌细胞发生表型转换，将其维持在分化状态，从而达到稳定斑块的效果[22]。进一步研究将其确定为一种新的血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）表型调节剂，高水平的CHI3L1 使肿瘤抑制基因（large tumor suppressor kinase 2，LATS2）表达下降，产生下游抑制效应，降低VSMCs 上的LGALS3 和IL6、IL1β 的表达，防止VSMCs 产生不良生物学行为，包括细胞凋亡和表型向“巨噬细胞样”状态转变[23]。另一方面，CHI3L1 介导动脉粥样硬化斑块内新生血管的形成，诱发斑块内出血，增加斑块不稳定性。试验证明CHI3L1 增强了人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）的迁移、成管和斑块内新生血管形成，且至少部分是由其细胞膜受体白细胞介素-13 受体α2 通过ERK 和AKT 信号通路介导的，因为该作用可被丝裂原活化蛋白激酶激酶和磷脂酰肌醇3-激酶的抑制剂显著抑制[24]。CHI3L1 对颈动脉粥样硬化斑块的影响是双重的，其在斑块发生发展过程中必然发挥了一定的促进作用，同时对于晚期易损斑块形成后又起了相当一部分保护作用。因此，CHI3L1不仅是一个可以预测不稳定动脉粥样硬化斑块存在的生物标志物，还可以作为斑块稳定性的调节因子。随着研究的进展，CHI3L1 在血管生物学上相互矛盾的作用机制解释清楚以后，将是一个理想的治疗靶点。

3.3 纤维蛋白原和纤维蛋白原γ'

纤维蛋白原（fibrinogen，Fib）在上级凝血因子作用下形成纤维蛋白网附着在血管内皮细胞表面，诱导血栓形成，进而沉积在血管内壁上加速粥样硬化斑块的进展。尤其在血浆脂蛋白促进血小板活化和聚集、稳定纤维蛋白网结构等作用下，进一步促进易损斑块的发展，大幅提高斑块破裂风险[25]。Fib与白蛋白的比率 (fibrinogen to albumin ratio,FAR)是一种新型炎症和血栓形成标志物，且既往研究表明Fib 和低血清白蛋白水平与急性缺血性卒中的不良预后有关，故有学者将之应用于急性脑梗死预后的预测，结果显示 FAR 值≥0.077 提示急性腔隙性脑梗死后3 个月的不良结局[26]。纤维蛋白原γ'（Fibγ'）是纤维蛋白原的一种亚型，具有抗凝血特性。已有报道称Fibγ'可以增加中国人群缺血性脑卒中的易感性[27]，但颈动脉易损斑块的作用机制一直未经明确阐述。而最新研究发现，Fib 和Fibγ'水平较高的患者与水平较低的患者相比，斑块内出血体积和富含脂质的坏死核心体积显著降低，且不受C 反应蛋白的影响[28]，说明Fib 和Fib γ'在易损斑块的发展中具有保护作用。这些研究让我们看到了纤维蛋白原在颈动脉易损斑块形成中的重要性。

3.4 纤维胶凝蛋白

最新研究发现，纤维胶凝蛋白（ficolin，FCN）与炎症标志物如髓过氧化物酶、基质金属蛋白酶8、基质金属蛋白酶9、细胞间黏附分子-1、骨桥蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶等表达水平呈正相关，在明视野显微镜下可见FCN 主要存在于斑块中富含胆固醇晶体的坏死核心区域[29]。FCN -2 与动脉粥样硬化患者中预测主要不良心血管事件的炎症蛋白——骨桥蛋白及斑块下游的巨噬细胞和中性粒细胞呈正相关，与动脉粥样硬化的保护因子高密度脂蛋白胆固醇呈负相关，但与SMCs 呈负相关，FCN-2 介导斑块内免疫细胞募集和炎症过程，最终导致斑块易损[30]。还有一个奇怪的现象，动脉粥样硬化患者的FCN-2 血清水平高于健康人群，但在易损斑块患者血浆中可见FCN-2 表达水平明显下降[29]，据此可以推测FCN-2 参与了动脉粥样的过程并不断积累，同时在疾病晚期的斑块侵蚀阶段被炎症不断消耗。此外，FCN-1 和FCN-3 也与炎症发生、易损斑块的形成密切相关，如FCN-3 表达水平的高低与颈动脉易损斑块形成呈负相关[31]。甚至在2 型糖尿病患者中，FCN-3 的升高可独立预测斑块形成的风险[32]。一项回顾性分析显示原发性高血压患者血清FCN-3 越低，颈动脉内膜中层的厚度随之增加，进而加速心血管疾病发展[33]。

3.5 血清信号素7A

血清信号素7A（semaphorin 7A，Sema7A）对动脉粥样硬化斑块的影响比较复杂，在不同的器官中有不同的促炎和抗炎作用[34]。Sema7A 通过激活mTOR和AKT2 信号通路诱导巨噬细胞趋化，激活巨噬细胞向M2 表型极化，促进白细胞清除，从而缓解炎症[35]。在颈动脉中主要以促炎为主，其升高与急性动脉粥样硬化血栓性卒中发病风险独立相关[36]。Sema7A 缺乏可减少T 细胞、巨噬细胞和树突状细胞的积累，并增强斑块稳定性[37]。最新研究发现，含Sema7A 基因的高脂饮食小鼠的左颈动脉血流紊乱促进了内皮细胞Sema7A 和细胞黏附分子的表达以及白细胞黏附和斑块形成，但是阻断已知的Sema7A 受体——β1整合素或抑制局部黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）则显著降低人脐静脉内皮细胞黏附分子的表达和单核细胞的黏附，表明Sema7A 通过β1整合素依赖性方式介导内皮功能障碍，促进易损斑块的形成[38]。Song 等[39]将HUVECs 暴露于50µg/ml ox-LDL 来模拟高脂血症诱导的内皮细胞损伤，结果显示HUVECs 活力显著降低，IL-1β、IL-6 和趋化因子配体2 等炎症因子被诱导产生，细胞黏附因子（cell adhesion molecules-1，CAM-1）和血管细胞黏附因子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表达水平显著上调，Sema7A 的敲低可以消除上述结果，然而β1 整合素的过表达又可以逆转Sema7A 敲低的效果。因此，Sema7A 敲低可以抑制炎症、细胞凋亡和内皮细胞间质化，起到一种保护效果，且该效果可被β1 整合素的过表达所抵消。内皮-间质转化（endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）在动脉粥样硬化中是一种常见的变化，Hong 等[40]发现Sema7A 通过膜受体β1 整合素上调转录因子ATF3，导致TGF-β2 转录增强和TGF/Smad3 信号通路激活，从而诱导EndMT，加速动脉粥样硬化的进展。因此，Sema7A 和β1 整合素可以作为治疗动脉粥样硬化中内皮细胞损伤和功能障碍的潜在靶点。

4 小结与展望

颈动脉易损斑块的发病机制比较复杂，想要更加精准地了解斑块发生发展的全过程，仍需在未来继续不断总结经验及深入探究。迄今为止，对于已经明确的可以作为易损斑块标志物的生物分子，大部分可作为心脑血管意外的独立危险因素，用于预测发生心脑血管意外的概率，但目前尚未在临床上广泛应用。另外，目前临床上药物治疗动脉粥样硬化斑块仍以阿司匹林及他汀类药物为主，主要起到延缓斑块进展的作用，期望今后可发现新的治疗靶点，进而研发出逆转斑块进展的新一代靶向治疗药物，减少由动脉粥样硬化斑块引起的心脑血管意外。