PI3K/AKT信号通路与新生血管性眼病的相关研究进展

陈来娇，郑磊，张国明

(1.暨南大学第二临床医学院，广东 深圳 518040；2.深圳市眼科医院/暨南大学附属深圳眼科医院，深圳市眼病防治研究所，广东 深圳 518040)

血管生成在胚胎发育、组织修复等生理过程中发挥重要的作用，一旦血管生成的调控机制失衡将会诱发病理性新生血管，给机体带来诸多危害。眼球是高度精密的视觉系统，拥有丰富的血液供应，各种各样的病理因素可能会促发血管的异常增殖而导致眼部新生血管性疾病，例如糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)、年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)、角膜新生血管(corneal neovascularization，CoNV)等，这些病变会严重威胁患者的视功能。因此，眼部异常血管调控机制以及拮抗其发生发展一直是研究的热点。而近年来的研究证实磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路[1]参与了新生血管性眼病的病理进程，本文将就此展开说明。

1 PI3K/AKT信号通路概述

PI3K本质上是一种激酶，存在于细胞质，具有蛋白激酶及磷脂激酶的双重活性。PI3K包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。Ⅰ型的底物主要是磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)、3-磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3-phosphate，PIP)及3,4-二磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol，3,4-diphosphate，PIP2)；Ⅱ型的底物主要是PI及PIP，Ⅲ型的底物主要为PI。Ⅰ型PI3K又包括ⅠA和ⅠB亚型，前者由调节亚基(p58)和催化亚基(p110)组成，其中p58包含SH2、SH3两个重要结构域。在正常情况下p58亚基与p110亚基结合导致PI3K失活，而PI3K的激活存在2种方式：一种是细胞受到某些含有磷酸化酪氨酸残基的生长因子的刺激，后者所包含的磷酸化的酪氨酸残基会与p58亚基的SH2 结构域相互作用，进而解除p58 对p110 的抑制作用，从而激活PI3K；另一种方式是通过Ras 蛋白和p110亚基直接识别并结合导致PI3K 活化。PI3K 激活后会导致PIP2转变为3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(3,4,5-phosphatidylinositol triphosphate，PIP3)，PIP3 作为第二信使可以与细胞内含有PH 结构域的AKT相互结合，导致AKT 转位于细胞膜上并获得相应的催化活性进行下一步的信号转导。

AKT又称为蛋白激酶B(protein kinase B，PKB)，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它是PI3K下游的关键蛋白，存在于细胞质中，AKT包括PH 结构域、催化结构域及调节结构域。在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1，PDK1)和 PDK2的分别作用下，苏氨酸蛋白和丝氨酸蛋白会发生磷酸化，当二者全部磷酸化后AKT 才被激活。激活的AKT由细胞膜再次转移到细胞质或细胞核内，进而继续靶向调控下游信号分子，如哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、Bad、周期蛋白D1、核转录因子κB等的表达。通过PI3K/AKT 信号通路的激活，可以对细胞生长、增殖、凋亡[2]、自噬[3]及细胞周期等多种生理功能发挥调控作用。

PI3K/AKT信号通路在生理和病理的血管生成中均发挥着重要作用，PI3K/AKT通路促进血管形成的机制为：活化的 AKT磷酸化内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)使其激活，激活产生的一氧化氮可刺激血管舒张、血管重塑和血管生成；PI3K/AKT信号还可通过多种途径上调缺氧诱导因子(hypoxiainducible factors-1α，HIF-1α)，促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其他血管生成因子的表达和分泌，刺激血管生成[4]。

2 PI3K/AKT与病理性新生血管眼病

2.1 PI3K/AKT与高糖模型DR是糖尿病最常见、最主要的微血管并发症之一，已经成为当前全球致盲的重要原因。其基本病理改变是视网膜的血-视网膜屏障的破坏，疾病晚期会合并视网膜新生血管形成、黄斑水肿，甚至视网膜脱离，导致失明[5]。根据疾病的进展程度可以分为非增殖期糖尿病性视网膜病变和增殖期糖尿病性视网膜病变。高血糖是公认的DR发生和发展的主要危险因素，此外DR还与多元醇代谢、糖基化终产物、甘油二酯、蛋白激酶C系统、氧化应激和自由基、炎症反应以及细胞因子等有关[6]，但至今其发病机制尚未完全阐明。近年来的研究证实，DR的发病进展与PI3K/AKT信号通路的异常活化密切相关。

视网膜病理性新生血管生成是DR患者致盲的主要原因，因此探索高血糖是如何引发这些血管内皮细胞增殖、“萌芽”一直是研究的热点。DJ-1在多种内皮细胞类型中发挥作用，包括人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和角膜内皮细胞。Tian等[7]发现DJ-1过表达可促进HUVECs增殖，抑制HG诱导的HUVECs Bcl2/Bax比值的降低和高糖激活的ROS的产生。过表达DJ-1可增加p-AKT/AKT比值、eNOS激活和NO的产生，并且这些趋势可被PI3K抑制剂LY294002部分逆转。此外，Wu等[8]在体外高糖模型培养的人视网膜血管内皮细胞(human retinal microvascular endothelial cells，HRMEC)中发现IA型PI3K的催化亚基(p110)明显高表达，可以进一步激活AKT而促进细胞增殖、迁移和体外成管。同样运用HRMEC，何静等[9]在高糖模型中发现高糖可诱导HRMEC中 miRNA 146a表达下调，而上调miRNA 146a表达可能通过降低白细胞介素-17A表达进而抑制PI3K/AKT通路激活，有效地降低高糖诱导的HRMEC增殖和新生血管生成。最近的研究报道，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)促进血管生成，并可能影响增殖、转移和凋亡[10]，EGFR的表达预示着DR的进展，Zhou等[11]首次证实成纤维细胞生长因子7(fibroblast growth factor 7，FGF7)在DR大鼠模型中高表达可促进内皮细胞和视网膜周细胞的增殖、迁移和侵袭；而miR-199a-3p通过靶向调控FGF7和抑制EGFR/PI3K/AKT通路的激活，从而减少血管生成，该研究为寻找DR的治疗方法提供了新的方向。以上研究初步证实了长期的视网膜高糖微环境可以通过PI3K/AKT信号通路的活化参与DR 病理性血管的生成。

视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelial cell，RPE)参与构成视网膜外屏障，对于维持正常的视网膜功能和稳态具有重要的作用。但由于RPE介于视网膜神经上皮层与脉络膜毛细血管层之间，容易受到体内高血糖的影响。大量的文献已经证实长期细胞内的高血糖紊乱会损害RPE的功能，参与DR的发病与进展，但机制不明。Liu等[12]发现在DR小鼠模型的RPE中，AKT1和AKT2的活性是相互调节的，AKT2基因敲除后通过代偿性上调AKT1的磷酸化水平，抑制血管损伤、炎症细胞因子的释放从而减轻糖尿病引起的视网膜异常，因此，靶向调控RPE中AKT1活性可能是治疗DR的一种新方法。同样是运用RPE细胞的体外实验，Treins等[12]用COCl2模拟DR缺氧状态发现可以明显增加HIF-1α和VEGF的表达，并且是通过PI3K/AKT/mTOR信号通路发挥作用，一旦使用PI3K的抑制剂后，缺氧状态下HIF-1α和VEGF的表达量随即降低。Lu等[14]通过建立DR模型及结合双荧光素酶基因测定评估microRNA-21和PTEN之间的靶向关系，发现DR大鼠视网膜组织中观察到miR-21和PI3K/AKT/VEGF相关基因表达增加，PTEN表达减少。其结果表明，miR-21过表达可能通过抑制PTEN表达激活PI3K/AKT/VEGF信号通路，从而潜在地刺激DR大鼠的视网膜血管内皮细胞活力和血管生成。同样地，Wang等[15]高糖模型中发现高糖降低HRMEC的 miR-199a-3p的相对表达水平，而miR-199a-3p过表达可通过抑制VEGF表达调节PI3K/AKT通路改善高糖刺激的HRMEC的血管生成。由此可见，PI3K/AKT信号通路是通过多种细胞交互影响以及复杂的信号网络参与DR的发病和进展。

2.2 PI3K/AKT与脉络膜新生血管模型脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是眼内新生血管的重要表现形式之一，与眼部多种疾病有关，如AMD、高度近视黄斑变性、眼组织胞浆菌病、特发性脉络膜视网膜炎、眼部肿瘤以及眼外伤等。CNV 常累及黄斑，引起反复出血、渗出、瘢痕形成，严重损害中心视力。迄今为止，CNV相关疾病的治疗仍是眼科学研究领域的热点。但其生成机制复杂多样，既包括多种细胞因子的参与，又包括一些视网膜病理结构的改变，例如Bruch膜损伤、RPE扰乱等[16]。近年来，一些研究发现PI3K/AKT信号通路也参与了CNV的形成。

激光诱导CNV动物模型是目前公认的研究CNV的重要手段。大量的文献已经证实HIF-1以及VEGF在CNV发病中发挥着重要的作用，但对于它们的调控机制尚未明确。Yang等[17]运用激光诱导兔CNV模型，发现激光作用可以明显上调p-AKT的表达，并且增高峰值位于激光诱导后3 d，与此同时会伴随着HIF-1和VEGF的表达增加。而在动物玻璃体内注射PI3K抑制剂LY294002后，HIF-1和VEGF的表达量明显降低，伴随着CNV的渗漏面积以及厚度明显减少。Yang等[18]发现整合素连接激酶(integrin-linked kinase，ILK)通过PI3K/AKT通路和MEK/ERK通路抑制培养的RPE细胞中HIF-1b、SDF-1b和VEGF的表达，而抑制ILK表达可以明显抑制CNV生长；以上2个研究均初步证实了PI3K信号通路通过调控HIF-1和VEGF的表达参与CNV的发生。对氧化应激具有保护作用的藏红花，可促进炎症反应，进一步促进CNV的形成，因此抗氧化应激已成为CNV治疗的靶点方向[19]。Qin等[20]分别在过氧化氢诱导的氧化应激模型及小鼠激光诱导CNV模型中证实藏红花在体内和体外均有抑制CNV的作用，其中藏红花通过抑制胰岛素受体底物(insulin receptor substrate，IRS)表达，导致PI3K、PDK1/2、AKT和BAD的磷酸化水平也降低，证实PI3K-PDK1/2-AKT-BAD信号通路参与了CNV的发病过程。

除此之外，在体外细胞模型中一些研究也证实PI3K参与CNV的形成。Jin等[21]将恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞(RF/6A)置于低氧环境下培养发现可以增加HIF-1α和VEGFR2的表达，促进RF/6A细胞增殖以及基质胶中细胞成管。这些细胞生物学能力的增加与细胞内PI3K通路的活化相关，p-AKT表达明显增强。而一旦使用PI3K抑制剂LY294002预处理后，低氧环境下RF/6A细胞的增殖和成管能力明显减弱，由此佐证了PI3K信号通路的激活对于CNV形成的重要性。

同样是利用RF/6A细胞系，Zhu等[22]通过在细胞培养液添加COCl2建立体外缺氧模型，发现p-PI3K、p-AKT和VEGF的表达上调，而抑制PI3K通路后，VEGF的表达明显下降同时伴随缺氧环境下RF/6A细胞的迁移和成管能力明显减弱。白藜芦醇(resveratrol，RSV)被证实在灵长类RF/6A、RPE细胞和其他类型的视网膜细胞中下调促血管生成因子，如VEGF。Zhang等[23]在小鼠CNV模型中评估了玻璃体内注射RSV的应用，并使用脉络膜内皮细胞进行了体外检测，发现玻璃体内注射RSV对CNV有抑制作用，其机制可能是通过抑制内皮细胞迁移、VEGFR2的磷酸化而实现的。而Wu等[24]的研究进一步证明PI3K/AKT信号通路参与影响 CNV 形成。他们在使用激光诱导CNV动物模型及RF/6A细胞系探究氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein ，OxLDL)与CNV形成的分子机制中发现，OxLDL通过在早期增加 VEGF 的表达，激活 MEK/ERK 途径来影响 CNV 的形成，再通过激活 PI3K/AKT 信号通路，诱导 TGF-β2/Smad 信号轴，从而导致内皮-间充质转化，影响 CNV 形成的后期。

除了上述动物和细胞的功能实验验证外，部分PI3K/AKT信号通路抑制剂拮抗CNV的研究也佐证了该通路在CNV形成中的重要作用。GSK2126458是已被证实的PI3K和 mTORC1/2的靶向抑制剂，Ma等[25]将其作用于激光诱导的小鼠CNV模型中，发现该药物可以减轻脉络膜血管渗漏和减少CNV面积，与抑制PI3K/AKT/mTOR通路后下调多个促血管生成因子表达有关，包括VEGF和PDGF等。GNE-947是另一种已被证实的PI3K和mTOR靶向抑制剂，Liu等[26]将其用于HUVECs的体外实验以及激光诱导CNV兔模型中，发现GNE-947不仅可以抑制HUVECs的体外增殖，还可以发挥拮抗动物模型中CNV形成效应，其潜在机制与GNE-947抑制了VEGF-VEGFR2对血管内皮细胞内PI3K/AKT通路的活化有关。因此，PI3K/AKT信号通路参与CNV的形成，而深入研究此通路也将进一步了解CNV的生成机制，为临床治疗提供新靶点。

2.3 PI3K/AKT与氧诱导视网膜病变模型氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy，OIR)模型具有模拟人类PDR部分病理生理过程的效应，也是常用的研究ROP发病机制和防治的重要实验工具，是目前研究该类型疾病最为重要的实验方法之一，可以为视网膜新生血管性疾病的防治提供重要依据[27-28]。ROP是早产儿尤其是伴有低体重儿发生的一种视网膜毛细血管发育异常化的双侧性眼病，表现为视网膜缺血、新生血管形成和增生性视网膜病变，重者可以引起视网膜脱离而导致永久性失明[29]。由于其后果严重，对患儿及其家庭造成巨大伤害，ROP 也日益引起人们的重视。目前ROP 的确切病因仍未明确，真正的发病机制尚不十分清楚。

Apelin是一种血管活性肽，为孤儿G蛋白偶联受体-血管紧张素受体样蛋白J受体(angiotensin receptor-like 1，APJ)的内源性配体，广泛分布于全身的组织和细胞，在维持机体稳态、血糖代谢以调节免疫等方面发挥重要作用。最近的研究显示在OIR小鼠模型中Apelin还可以促进缺氧诱导的视网膜病理性血管生成，潜在机制正是与p-mTOR、p-AKT的过表达有关[30]。

富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich 61，Cyr61)是一种与ECM相关的立早基因编码蛋白，在发育和病理状态下，其主要表达在血管化和骨骼生长部位。Di等[31]在OIR小鼠模型中发现缺氧条件下可以明显增加视网膜病理性血管的数量，伴随着Cyr61、PI3K和AKT的表达上调。而在小鼠玻璃体腔内注射Cyr61的siRNA后则会明显减少病理性新生血管生成，并且Cyr61的表达被证实与PI3K通路的活化有关。此外，Di等[32]在缺氧条件下用 LY294002处理人脐静脉内皮细胞，发现LY294002通过下调 PI3K、 AKT 和 VEGF 在体内外的表达来抑制视网膜新生血管，主要由于 LY294002易于通过细胞膜并通过竞争性抑制 PI3K 亚基中的 ATP 结合位点来抑制 MAPK活性。

为了探究普萘洛尔影响ROP的潜在机制，Su等[33]建立小鼠OIR模型，发现腹腔注射普萘洛尔的小鼠中穿透视网膜内界膜的血管内皮细胞核数量减少，初步证实了普萘洛尔对 ROP 的治疗效果，进一步分析发现OIR 小鼠 HIF-1α 和 PI3K/AKT/ERK 通路蛋白水平显著升高，表明 PI3K/AKT/ERK/HIF-1α 轴与普萘洛尔诱导的 ROP 缓解相关。

胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF-2)是胰岛素样生长素家族的成员之一，IGF-2在血管生成过程中促进视网膜微血管内皮细胞迁移和血管形成。Zheng等[34]使用生物信息学技术比较了IGF-1、IGF-2、IGF-1R和IGF-2R的氨基酸序列，鉴定出一种新的12个氨基酸，具有LCGGELVDTLQF序列的肽(命名为CW-703)，在小鼠OIR模型观察到磷酸化和VEGF的表达增加，提出CW-703可能通过阻断典型信号通路：CW703与IGF-1R结合的IGF竞争，抑制IGF-1R和下游信号分子PI3K/AKT的磷酸化，导致VEGF表达减少抑制视网膜新生血管。

由以上可以看出，PI3K/AKT通路参与介导的ROP发病是需要通过不同的中间媒介蛋白发挥作用，可能并不是简单地调控VEGF的表达来发挥促血管生成的效应。进一步探索其相关媒介蛋白，将有助于了解ROP的发病机制并发现更多可能有效的治疗手段。

2.4 PI3K/AKT与角膜新生血管模型无血管化是角膜的主要特性，但是在外伤、感染等病理变化时，从角膜缘血管网形成的新生毛细血管会逐渐侵入角膜而形成角膜新生血管(corneal neovascularization，CoNV)。CoNV可引起角膜正常微环境的破坏，使眼前节段相关的免疫赦免偏离，也会导致角膜组织瘢痕化和持续性炎症，从而最终致盲。因此揭示CoNV的发病机制及寻找有效的治疗方法仍是急需解答的问题。

碱烧伤诱导动物CoNV是研究该疾病最常用的体内实验方法，基于此已经有大量的研究证实PI3K/AKT参与CoNV的发病。Li等[35]证实碱烧伤会诱导兔角膜组织中DNA甲基化修饰，从而进一步增加PI3K/AKT通路的下游效应子TSC1和mTOR的表达，上调VEGF水平引起CoNV生成。EZH2属于DNA甲基化修饰中比较经典的甲基转移酶，Wan等[36]发现EZH2的表达与碱烧伤后动物CoNV的产生呈正相关，而药物性拮抗EZH2的表达后，可以抑制碱烧伤导致的氧化应激反应和病理性新生血管生成，其机制是EZH2的下调干扰了PI3K/AKT的信号转导，导致该通路下游靶点FoxO3a 的表达减少，而FoxO3a正是与血管生成密切相关。既往研究表明，沉默S100 钙结合蛋白A4(S100 calcium binding protein A4，S100A4)基因后，可抑制碱烧伤后CNV形成[37]，Wang等[38]在兔角膜碱烧伤模型中进一步研究其机制发现，S100A4基因在兔角膜基质细胞中沉默时，VEGF和TNF-α的mRNA和蛋白水平降低，PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平降低，推测沉默基因S100A4通过阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路，从而抑制兔角膜基质细胞的炎症反应和自噬，提出了以S100A4为靶点的角膜修复方法。

除了上述的复杂机制调控外，部分药物对于CoNV生成抑制的研究，比较简单清晰地佐证了PI3K/AKT通路参与了CoNV的生成。例如，Shen等[39]将黄嘌呤素用于角膜碱烧伤的小鼠模型研究中，发现能够抑制CoNV的形成，其机制主要是黄嘌呤素能显著抑制PI3K和AKT的磷酸化水平，下调VEGFR2表达，从而抑制CoNV的形成。DCZ3301是一种新型的芳基胍基化合物，Xu等[40]在碱烧伤诱导的CoNV小鼠模型中发现DCZ3301可明显缩小角膜新生血管面积，减轻角膜基质水肿，潜在的机制也是由于DCZ3301可以降低PI3K和AKT的磷酸化水平有关。Chen等[41]观察到在碱烧伤兔模型中尼达尼布可以显著抑制角膜CoNV及减少碱烧伤角膜组织的病理变化，主要由于局部应用尼达尼布降低碱烧伤诱导的VEGF表达，其机制可能与尼达尼布抑制碱烧伤刺激的AKT、p-AKT等的上调有关，其有可能预防CoNV的形成。CoNV的形成与PI3K/AKT信号通路的表达紧密相关，深入探索PI3K/AKT通路将有助于发现CoNV的发病机制、预防用药及有效的靶点治疗。

3 总结与展望

眼球是一个精密的视觉器官，任何部位异常的新生血管形成都可能会给患者的视功能带来损害。而作为一种由多种因素导致的病理改变，这些异常新生血管的生成和调控机制具有一定的相似性，同时又是复杂多样的。本文综述了PI3K/AKT信号通路在部分眼部病理性新生血管中的重要作用，使用模型如DR高糖模型、激光诱导的CNV模型、OIR模型及CoNV模型等。此外，本综述还挖掘了一些具有抑制血管生成效应的通路靶向抑制剂，例如LY-294002、LY294002、GSK2126458、GNE-947、DCZ3301等，其良好的抗病理性血管生长的作用预示着它们在未来的研究中可能具有更高的价值。许多眼部疾病的进展与异常新生血管密切相关，因此，未来可以更具倾向性地研究PI3K/AKT信号通路在这些疾病中的作用，以提供更多的临床治疗策略。