新疆双峰驼C3d基因cDNA的克隆与序列分析

娜斯拜·阿卜杜瓦哈普,高晓娟,坤杜孜阿依·阿布都沙拉木,李江伟

(新疆大学生命科学与技术学院/省部共建新疆生物资源基因工程重点实验室,乌鲁木齐 830046)

0 引 言

【研究意义】C3蛋白是补体系统的核心成分,在宿主天然免疫防御中发挥关键作用。C3d分子是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁[1-2],可以与B细胞表面的CR2/CD21(补体受体2)结合,刺激机体的免疫系统,增强B细胞活力,降低反应阈值,并具有免疫佐剂效应[3-10]。新疆双峰驼具有极强的抗病性能,有关骆驼抗病性能的机制、尤其是其免疫防御的机制研究甚少,一些基础资料欠缺,有必要对骆驼开展有关免疫生物学等方面的基础研究。研究对双峰驼固有免疫的重要成分补体C3d基因的克隆,积累骆驼免疫学基础数据,分析其基因序列,了解其保守性,为开发基于C3d的分子免疫佐剂提供依据。【前人研究进展】 人的C3d位于C3分子的第996-1303位氨基酸残基,由308个氨基酸组成。在C3转化酶的作用下,C3分子裂解成C3a和C3b。C3b受血清中I因子、H 因子和蛋白酶的作用,又可逐级水解为i3b、C3f、C3c、C3dg、C3d和C3g等片段,其中C3d由C3dg裂解而来,是补体C3分子被蛋白酶裂解的最小片段,始终与抗原共价结合。自从Dempesy P W 等[11]利用基因工程领域的方法将鸡卵溶菌酶(HEL)分别与小鼠C3d分子串联制备成融合蛋白免疫小鼠,发现C3d分子偶联的HEL的免疫原性比单纯HEL增强1 000倍,其佐剂作用远远大于完全弗氏佐剂。通过采用部分动物的C3d基因进行基因疫苗构建和表达融合蛋白等多种方式,大大促进了疫苗的免疫原性,抗体的效价和细胞免疫水平等方面的研究[12-13]。Green等[14]利用HIV-1衣壳蛋白gp120编码基因,分别与1～3个拷贝的小鼠C3d基因融合,构建了不同的重组质粒免疫小鼠,检测血清抗体的亲和力,以gp120-3C3d免疫组小鼠的抗体亲和力最佳;正常机体和病理状况下的血清中C3d在活性与含量水平上有一定的区别。Brinas等[15]将C3d的部分氨基酸作为B细胞活化的分子佐剂与肿瘤抗原一起结合至球形金纳米颗粒表面,制备成新型肿瘤疫苗,证明该疫苗制备平台可作为肿瘤相关抗原的运载系统使用。C3d具有可作为良好佐剂的应用前景。【本研究切入点】 目前研究人员已从多种动物中克隆得到了C3基因,包括人、鼠、牛、羊、马、猪、兔、鸡等,但对骆驼科动物C3基因的研究还未见报道, 也未见对新疆双峰驼C3基因的克隆。以往报道由于C3d有较大的种属特异性,作为佐剂,不同动物的C3d是否具有通用性还是未知。骆驼科动物因具有独特的重链抗体,是目前制备纳米抗体的主要宿主[10],需研究新疆双峰驼C3d基因的克隆和与其他动物的同源关系。【拟解决的关键问题】 补体包括C3主要由肝脏细胞表达,选择骆驼肝脏作为基因克隆的起始材料,分析各物种C3d基因序列的保守性,选择合适的引物克隆c3d基因。通过该基因的克隆和序列分析,有助于选择合适的C3d分子佐剂从而提高骆驼免疫的效果,为进一步研究C3d作为分子佐剂提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

3年龄雌性新疆双峰驼来自新疆华凌农牧信息科技有限公司屠宰场。大肠杆菌菌株BL21(DE3)(全式金生物技术有限公司),原核表达载体pMD18-T(TAKARA),限制性内切酶NcoI、XhoI(TAKARA),双酶切试剂(TAKARA),总RNA翻转试剂盒(TAKARA),PCR扩增试剂盒(TAKARA),回收纯化试剂盒(OMEGA),小提质粒试剂盒(OMEGA),Trizol。

1.2 方 法

1.2.1 引物设计与合成

根据NCBI上公布的预测的骆驼C3序列(XM_010966781.1)以及与其他动物相关序列同源性比较的基础,设计特异性引物(斜体部分分别为NcoI和XhoI两个酶切位点)。表1

表1 PCR扩增新疆双峰驼C3基因引物序列Table 1 The primers of C3 gene of Bactrian camel in Xinjiang were amplified by PCR

1.2.2 肝组织总RNA提取、和RT-PCR扩增C3d骆驼基因

双峰驼屠宰后,立刻用无菌手术剪将肝脏右叶快速取出,剪成1 cm组织块后,包裹在锡箔纸中,投入液氮冻存备用。肝脏总RNA的提取采用李世军等[16]所描述的方法,利用TRIZOL试剂进行提取。提取的肝脏总RNA为模板,按照TAKARA公司的反转录试剂盒说明建立反应体系:1.3 μL总RNA,4 μL Prime Script RT Enzayme mix,4 μL 5×Prime Script Bμffer,1 μL RT Primer mix,用去离子DEPC水补足至总体积10 μL, 42℃水浴30 min,进行反转录合成cDNA。以反转录的cDNA为模板,采用C3d基因特异引物进行PCR扩增。PCR反应条件如下:95℃ 预变性5 min, 94℃,30 s, 69.7℃ 30 s, 72℃ 1 min, 扩增35个循环,72℃延伸 10 min, 4℃保存备用。

1.2.3 C3d的克隆和鉴定

将回收纯化后的C3d基因和pMD18-T载体经双酶切处理后在16℃水浴过夜连接,将连接过后的产物转化至感受态菌E.coliBL21(DE3),平板涂布并放置于37℃恒温箱过夜培养。挑取平板上的阳性克隆,经过菌液PCR和质粒双酶切筛选鉴定阳性菌落后送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。

1.2.4 C3d基因序列

使用DNAStar和Swiss-Model软件对新疆双峰驼C3d基因序列的二级和三级结构进行预测,使用DNAMAN,ClustW软件对双峰驼C3d预测序列与双峰驼C3d克隆序列、单峰驼、家兔、牛、人、鼠、羊驼、野驼、猪的C3d氨基酸序列之间进行多重比对并建立系统进化树。

2 结果与分析

2.1 骆驼肝脏组织总RNA纯度

研究表明,2条RNA带(28S和18S),和1条5S低分子量RNA带。其定量结果为1.708 μg/μL, OD260/OD280值1.92,RNA的纯度较高。图1

图1 骆驼肝脏组织总RNA

2.2 C3d 基因的RT-PCR扩增

研究表明,扩增双峰驼C3d基因获得约900 bp大小的单一特异性条带,同预期的结果相符。图2

注:M:10000 bp DNA marker;1:阴性对照;2:双峰驼C3d基因PCR产物;

2.3 重组载体鉴定

研究表明,有3个阳性单克隆菌落,对其质粒进行NcoI和XhoI双酶切实验,获得有900 bp(C3d)和2700 bp(载体)左右大小的两个条带,同预期的结果相符。图3

注:M:10000 bp DNA marker;1:pMD18-T-C3d单酶切产物; 2:pMD18-T-C3d双酶切产物

2.4 基因序列

研究表明,双酶切鉴定为阳性的重组菌株送测序。重组序列总长度为923 bp,与预期结果相符(斜体部分分别为NcoI和XhoI酶切位点)。用DNAstar和Swiss-Model软件对双峰驼C3d基因蛋白的二级和三级结构预测得知C3d有10个α-螺旋,7个β-折叠,15个T-转角,且具有良好的抗原性。“MHPAVFLSLPDLRCSLLLLVTWVFTPVT”为信号肽序列,第29个氨基酸(T)是被信号肽酶切割的位点。由于C3d没有跨膜区域,但存在信号肽序列,被分泌至细胞外,分布在血液和组织液当中。将扩增获得的新疆双峰驼C3d和不同物种C3d蛋白利用DNAstar软件分析蛋白氨基酸序列的理化性质,由pH7时所带的电荷数得知,不同物种来源C3d在蛋白相互作用中活性存在显著差异。带电荷量越多分子活性越强,在不同来源C3d蛋白中双峰驼C3d具有较强的结合活性。不同物种C3d蛋白疏水性平均值和抗原性指数分别在0.07～0.36和0.37～0.53范围内。

重组序列测序结果与GenBank预测序列一致。骆驼科之间C3d基因的同源性在97%以上,与牛、猪、兔的C3d基因同源性逐渐偏远,分别为,88%、88%、83%和83%。图4～7、表2～3

图4 新疆双峰驼C3d基因碱基序列

图5 新疆双峰驼C3d基因二级及三级结构

图6 不同物种间C3d氨基酸序列的多重比对

表2 新疆双峰驼补体C3d二级结构Table 2 Analysis of secondary structure of complement C3d of Bactrian camel in Xinjiang

表3 新疆双峰驼补体C3d蛋白理化性质Table 3 Analysis of complement C3d protein of Bactrian camel in Xinjiang

图7 不同物种C3d基因系统进化树

3 讨 论

3.1C3d是补体系统的核心分子,C3在其转化酶作用下先裂解为C3a和C3b,其中C3b再裂解为C3c和C3d,相比于其它蛋白,C3d不被蛋白酶裂解但仍保持与抗原共价连接的最小片段,它能够转移至血清中并稳定存在[4]。由稳定性强等优点,C3d作为分子佐剂在疫苗中有广泛应用。

3.2在骆驼体液免疫反应中,除产生常规的IgG抗体外,还产生天然缺失轻链的重链抗体。C3d作为B细胞激活的刺激分子,是否参与重链抗体的产生值得研究。研究克隆的C3的基因为今后表达该蛋白和研究其在骆驼B细胞体液免疫激活中的作用提供了材料。目前,制备纳米抗体主要利用骆驼来进行免疫获得。对骆驼的免疫过程需要mg级的抗原蛋白,这限制了一些针对体外难以表达的蛋白的纳米抗体的制备。纳米抗体作为一种特殊抗体,在医学研究中备受关注[17]。通过采用与抗原融合C3d分子佐剂的方式已经在其他动物中证明可以极大提高免疫效价,并且降低抗原的用量。骆驼C3d基因的克隆,一方面在纳米抗体的利用及开发具有一定的价值,另一方面能够为骆驼C3d蛋白的综合利用提供基础和参考。

3.3对不同动物体中C3d的克隆方法,完成了骆驼C3d基因的克隆研究[18]。通过生物信息学软件对所得到的基因序列进行分析发现,测序结果与预测序列相符,此外骆驼属间补体C3d基因的亲缘性较高,可能具有相似的结构和功能。与牛、猪等动物补体C3d基因亲缘性高,而与兔、人有一定的差异。鼠的C3d与骆驼的C3d的氨基酸的亲缘性最低。不同物种间C3d具有一定的差异,骆驼C3d具有种属特异性,用于异源可能会引起针对C3d的免疫应答。

4 结 论

从骆驼肝脏组织中克隆得到了长度为909个bp,编码303个氨基酸的C3d基因,与骆驼科C3d基因之间的同源性在97%以上, 与牛和猪C3d基因同源性为88%,与兔和人的C3d基因同源性为83%。该C3d基因在进化中具有保守性,在骆驼免疫中可以采用亲缘关系较近的动物来源的C3d作为分子佐剂从而增强骆驼免疫效果。